Introduzione
La migrazione cellulare è un processo essenziale e altamente regolato coinvolto nello sviluppo embrionale, nell’omeostasi e nella rigenerazione dei tessuti. La migrazione cellulare svolge anche un ruolo chiave nel cancro, dove guida la generazione delle metastasi tumorali [1-5].
I modelli 2D di migrazione cellulare sono ben consolidati e sono strumenti preziosi per comprendere i complessi meccanismi che regolano la migrazione cellulare normale e anormale [6]. I saggi di migrazione basati sulla chiusura della ferita (“scratch wound” o “gap closure”) e quelli sul movimento casuale delle cellule sono i più comunemente studiati; il primo è altamente rilevante per lo studio dei meccanismi di guarigione delle ferite e la migrazione collettiva di tipi cellulari che formano giunzioni strette (ad es. i melanociti), mentre il secondo è più adatto per osservare il comportamento di colture cellulari che migrano come singole cellule, come le linee di cellule tumorali tipo fibroblasti. Per questa ragione, è importante per i ricercatori tenere in considerazione quale saggio sia il più adatto per studiare il loro modello cellulare al fine di produrre dati rilevanti.
Il test di migrazione casuale delle cellule richiede un’analisi a livello della singola cellula e fornisce delle informazioni molto approfondite riguardo ad esempio la velocità, lo spostamento cellulare e la direzionalità; tuttavia, esistono non poche difficoltà nell’ottenimento di questi dati in modo affidabile ed efficiente.
L’imaging tradizionale in label-free non fornisce un contrasto sufficiente ad eseguire la segmentazione e il tracciamento automatizzati delle cellule, mentre l’introduzione di marcatori fluorescenti per aumentare il contrasto ha il potenziale di alterare la normale funzione cellulare e influenzarne la migrazione [6-10]. Sono stati sviluppati e riportati diversi algoritmi automatizzati di localizzazione cellulare [11, 12], tuttavia, nessuno di questi fornisce un flusso di lavoro completo ed efficiente che comprenda l’analisi delle immagini, il monitoraggio delle cellule e la visualizzazione dei dati per i saggi in micropiastra.
In questo studio abbiamo cercato di quantificare direttamente la migrazione casuale di singole cellule MDA-MB-231 durante un periodo di 24 ore usando il sistema Livecyte di Phasefocus. È stata eseguita la misurazione automatizzata della migrazione di singole cellule utilizzando la pticografia, una tecnica di imaging in label-free che misura direttamente il ritardo di fase della luce che passa attraverso il campione (Quantitative Phase Imaging – QPI) e il pannello software dedicato alla motilità cellulare.
Materiali e metodi
Colture cellulari
Le cellule MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) sono state mantenute in DMEM (Gibco) + 10% siero fetale bovino FBS (Gibco) a 37°C con 5% CO2 e 95% umidità prima degli esperimenti. Le cellule sono state raccolte usando tecniche standard, conteggio e vitalità cellulare sono state determinate con saggio trypan blu (ViCell; Beckman Coulter). Sono state inoculate 1500 cellule/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti (Corning 3603) e messe in coltura overnight. Il terreno di coltura è stato sostituito con DMEM senza siero (SFM) e le cellule sono state mantenute in assenza di siero per 24 ore. Prima dell’imaging, il terreno è stato sostituito con solo SFM o SFM con EGF (1-30 ng/ml; Gibco PHG0313), 10% FBS o citocalasina D (300ng/ml; (Thermo Fisher PHZ1063).
Time-Lapse Imaging
Le immagini QPI senza marcatura sono state generate tramite il software automatizzato Acquire di Livecyte e l’algoritmo di ricostruzione pticografica. Le cellule sono state monitorate con un obiettivo PLN 10X / 0,25NA e un campo visivo di 1 mm x 1 mm (FOV) per pozzetto per 24 ore a intervalli di 12 minuti. Durante l’imaging, le cellule sono state mantenute in un ambiente a 37°C con 5% di CO2 e 95% di umidità.
Risultati e discussione
Gli effetti dell’assenza di siero, della presenza di 10% FBS (mezzo completo), di EGF e della citocalasina D sulla migrazione delle cellule MDA-MB-231 sono stati esaminati per 24 ore usando il sistema Livecyte. L’elaborazione delle immagini, la segmentazione automatizzata e il tracciamento delle cellule sono stati eseguiti in modo completamente automatico con il software Analyse del sistema Livecyte. Le metriche su singola cellula sono state estratte utilizzando il pannello dedicato alla motilità cellulare.
Segmentazione e tracciamento delle singole cellule
Le immagini in label-free ad alto contrasto generate dal sistema Livecyte consentono una solida segmentazione delle singole cellule (Figura 1; in alto). Gli algoritmi di analisi del Livecyte utilizzano diversi valori derivanti dai dati di segmentazione per fornire un tracciamento affidabile per ogni singola cellula, come mostrato nella Figura 1 (in basso).
Figura 1. Immagini rappresentative QPI delle cellule MDA-MB-231 con maschere di segmentazione (in alto) e tracciati di singole cellule nell’arco temporale di 24 ore (in basso). Barra della scala = 200μm.
Pannello della motilità cellulare
Il sistema Livecyte raccoglie automaticamente i dati di immagine, di segmentazione delle singole cellule e del tracciamento delle cellule in un pannello interattivo dedicato (Figura 2). I dati su più pozzetti sono ordinati per gruppo di trattamento e le metriche di migrazione di ogni cellula sono generate sotto forma, ad esempio, di velocità cellulare media, velocità istantanea e grado di spostamento. Sono anche disponibili video multi-pannello per visualizzare in anteprima la migrazione delle cellule in ciascun trattamento o condizione.
Figura 2. Immagine rappresentativa del pannello dedicato alla motilità cellulare. L’analisi delle immagini, la segmentazione delle singole cellule e i dati di tracciamento su più pozzetti vengono automaticamente convertiti in metriche di migrazione cellulare.
Velocità cellulare media
Le cellule MDA-MB-231 hanno mostrato un aumento nella velocità migratoria media e istantanea proporzionali alla quantità di EGF presente in coltura (Figura 3 e 4). Come previsto, le velocità di spostamento e di migrazione medie più elevate sono state osservate in terreni completi (siero al 10%), mentre le cellule esposte alla citocalasina D, una tossina che inibisce la polimerizzazione dell’actina, mostrano velocità migratorie medie più basse (Figura 3 e 4).
Figura 3. Velocità migratoria media delle cellule MDA-MB-231 durante un periodo di 24 ore in ciascuna condizione di trattamento.
Figura 4. Velocità istantanea media delle cellule MDA-MB-231 durante un periodo di 24 ore in ogni condizione di trattamento. Le barre rappresentano media, 25esimo e 75esimo percentile.
Profili di migrazione casuale
Il sistema Livecyte calcola anche lo spostamento cellulare e il confinamento cellulare per studi di migrazione casuale. Queste metriche rappresentano la distanza che una cellula percorre rispetto al suo punto di origine e considera anche quanto una cellula “girovaga” dal suo punto iniziale per raggiungere quello finale.
Mentre le cellule nei terreni completi mostrano la più alta velocità migratoria media, il loro grado di confinamento risulta inferiore a quello delle cellule trattate con EGF a 10 e 30 ng/ml. Questi risultati sono stati osservati anche nei grafici del grado di spostamento cellulare (Displacement), suggerendo che le cellule trattate con EGF a 10 e 30 ng/ml, in media, sono migrate più lontano dal loro punto di origine rispetto alle cellule in terreno completo (Figure 5 e 6) e mette in evidenza i diversi profili di migrazione tra questi gruppi. Come anticipato, le cellule trattate con citocalasina D hanno mostrato il più basso grado di confinamento e spostamento, indicando che sono migrati molto poco dal loro punto di origine (Figura 5 e 6).
Figura 5. Grado medio di confinamento delle cellule MDA-MB-231 durante un periodo di osservazione di 24 ore in ogni condizione di trattamento.
Figura 6. Grafici di spostamento che mostrano la distanza percorsa dalle cellule MDA-MB-231 dall’origine per un periodo di osservazione di 24 ore in ogni condizione di trattamento.
Conclusione
L’estrazione dei dati di migrazione delle singole cellule senza l’uso di marcatori fluorescenti perturbanti può essere impegnativa con i tradizionali approcci di imaging in label-free a causa della mancanza di contrasto intrinseco delle cellule e dell’inefficienza dei flussi di lavoro dall’acquisizione di immagini all’analisi e alla visualizzazione dei dati.
Il sistema Livecyte combina automaticamente l’imaging in label-free ad alto contrasto con algoritmi di tracciamento di ogni singola cellula per generare e visualizzare le metriche di migrazione tramite il pannello software dedicato alla motilità cellulare.
Utilizzando il saggio di migrazione cellulare casuale, riscontriamo un aumento della velocità di spostamento delle cellule MDA-MB-231 proporzionale alla quantità di EGF presente nel terreno di coltura. Le cellule cresciute in presenza di EGF si muovono più rapidamente rispetto ai gruppi cresciuti in assenza di siero (SFM) o in presenza di citocalsina D, mentre la più alta velocità di spostamento si riscontra nelle cellule in terreno completo. Abbiamo anche osservato che le cellule trattate con EGF a 10 ng/ml e 30 ng/ml, in media, hanno migrato più lontano dal loro punto di origine rispetto al gruppo in terreno completo nonostante la migrazione avvenga a velocità più lenta, suggerendo diversi modelli di migrazione.
Questo studio dimostra come l’utilizzo la modalità di imaging QPI del sistema Livecyte e il pannello software dedicato alla motilità cellulare permetta di estrarre e visualizzare automaticamente i dati sulla migrazione di singole cellule evitando i limiti di fluorescenza o i colli di bottiglia derivanti dall’analisi manuale di tracciamento ed elaborazione dati. Il sistema Livecyte fornisce un flusso di lavoro intuitivo che consente agli utenti di semplificare i saggi di migrazione cellulare casuale ed esaminare in modo affidabile le vie metaboliche coinvolte nella regolazione della migrazione cellulare.
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