Analisi della distribuzione dimensionale con Nanosight Pro – FTLA o RAW?

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Analisi della distribuzione dimensionale con Nanosight Pro – FTLA o RAW?

Analisi delle dimensioni delle nanoparticelle utilizzando la Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

La Nanoparticle Tracking Analysis è conosciuta per la alta risoluzione della distribuzione particella per particella, ma cosa intendiamo esattamente con “alta risoluzione”? Questo approfondimento tecnico esplora due metodologie per la tracciatura dei dati di distribuzione con il NanoSight Pro, finalizzato a aumentare l’affidabilità nell’analisi di particelle polidisperse.

Le particelle sono state osservate muoversi secondo il moto Browniano all’interno del campo visivo del software del NS Xplorer. Il software registra video della durata compresa tra 25-60 secondi, identificando e tracciando simultaneamente, fotogramma per fotogramma, i centri delle particelle visibili. Viene quindi calcolata la distanza media percorsa da ciascuna particella lungo i piani x e y, determinando così lo spostamento quadratico medio (MSD). Il valore di MSD viene successivamente convertito nel diametro idrodinamico (dh) mediante l’equazione di Stokes-Einstein (Equazione 1).

Equazione 1: l’equazione di Strokes-Einstein dove MSD rappresenta lo spostamento quadrico medio delle particelle, KB è la costante Boltzmann, T è la temperatura, η è la viscosità e dh è il diametro idrodinamico.

L’algoritmo del NS Xplorer (e le precedenti versioni del software NTA) deve tracciare una il movimento di una particella attraverso sufficienti fasi del moto browniano per determinare accuratamente la lunghezza media dei passaggi e così la grandezza idrodinamica. Le particelle piccole, tuttavia, sono limitate dal volume di scattering e dal tempo limitato in cui rimango all’interno del campo visivo (i.e. < 10 frame = 0.3 secondi a 30 frame per secondo (fps)). Tali limitazioni possono occasionalmente dare origine a un allargamento artificiale della distribuzione, pur mantenendo accurata la dimensione media. Per far fronte a ciò, il software del NS Xplorer e del NTA impiegano un modello matematico per compensare le traiettorie limitate nel moto Browniano ( Saveyen et al, 2010). Questo modello è conosciuto come “finite track length adjustment” (FTLA). La FTLA compensa gli effetti di allargamento e presenta un’ampiezza di distribuzione corretta (Figura 1).

 

Figura 1: Il modello FTLA è appropriato per campioni che contengono popolazioni multiple, discrete e risolvibili. La FTLA inoltre aiuta l’estrazione delle distribuzione dimensionale monodispersa delle perle di lattice da 100nm.

L’FTLA tipicamente si applica a campioni monodispersi o polidispersi con discrete popolazioni di miscele bimodale o trimodali. Le distribuzioni RAW forniscono una maggiore consapevolezza per ulteriori campioni polidispersi e assicurano una buona riproducibilità delle misurazioni in sistemi più complessi. La figura 2 illustra l’aumento della polidispersione in campioni complessi tra le distribuzioni FTLS (rosso) e RAW (blu). I dati RAW riflettono riflettono la “vera” eterogeneità del campione con una distribuzione di dimensioni ampia, senza compromettere la risoluzione dei picchi di spalla individuali della distribuzione principale.

 

Figura 2: Il modello RAW (rosso) è appropriato per i campioni che sono polidispersi  e che presentano una distribuzione dimensionale continua

La figura di sotto illustra ulteriormente come le distribuzioni FTLA e RAW influenzino la riproducibilità dei dati.

 

Figura 3: Distribuzione dimensionale degli esosomi presentata come RAW e FTLA

 

Figura 4: La distribuzione delle dimensioni degli esosomi FTLA mostra una ridotta riproducibilità.

Le analisi RAW possono essere una soluzione migliore per le popolazioni altamente polidisperse dove la FTLA potrebbe accentuare popolazioni discrete e quindi ridurre la riproducibilità tra le misurazioni (figura 4).

L’algoritmo FTLA si basa sul predire la lunghezza dei percorsi individuali di ciascuna particella per un periodo di tempo teoricamente infinito, offrendo un picco di distribuzione dimensionale ristretto. Questo algoritmo raggruppa le particelle di dimensioni simili in differenti intervalli di distribuzione. Tuttavia, questa operazione risulta più complessa quando i campioni sono altamente polidispersi, poiché le dimensioni variabili delle particelle rendono più difficile la distinzione tra gli intervalli dimensionali. Il grafico finale della distribuzione si mostra meso riproducibile attraverso diverse misurazioni con la FTLA. Il grafico delle distribuzioni RAW mitiga questa variazione, presentando così una migliore riproducibilità su numerose misurazioni del campione (figura 5).

 

Figura 5: Distribuzione dimensionale RAW di esosomi mostra l’incremento della riproducibilità.

Sia le modalità FTLA che RAW sono utili per valutare popolazioni discrete. La distribuzione RAW potrebbe presentare un picco individuale che può o no sembrare una spalla al fianco della popolazione principale (figura 6). Cambiando da RAW a FTLA si conferma ulteriormente la discreta presenza del secondo picco rispetto alla popolazione principale, indicando che la porzione significativa del campione ha un diametro maggiore (figura 7).

 

Figura 6: Distribuzione dimensionale RAW di nanobolle.

 

Figura 7: Distribuzione dimensionale FTLA di nanobolle

Sommario

La tabella riportata di seguito riassume quando si dovrebbe scegliere tra analisi FTLA o RAW per le distribuzioni dimensionali nell’ambito della Nanoparticle Tracking Analysis.

Modello di analisi Quando Utilizzare Quando evitare
FTLA
  • Analizzare perle dalla dimensione conosciuta
  • Cercare popolazioni discrete
  • Ideale per campioni puri e non contaminati
  • Cercare di identificare e caratterizzare popolazioni dalle grandezze conosciute con miscele complesse
  • Confrontare lotti di campioni monodispersi, ad esempio attraverso il processo di produzione
  • Campioni eterogenei come le EVs
  • Studiare la purezza di miscele complesse
RAW
  • Analizzare campioni polidispersi come campioni biologici, incluse le vescicole extracellulare, gli aggregati di proteine e le nanobolle
  • Quando la riproducibilità di un campione complesso è importante
  • Cercare discrete popolazioni o distribuzioni con dimensioni conosciute

 

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