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27 Gennaio 2022

Andrea Pigozzo

Cavalca l’onda della caratterizzazione cinetica!

Lo studio delle interazioni molecolari per la caratterizzazione di cinetiche e affinità rappresenta un tassello fondamentale della ricerca chimico e bio-farmaceutica. Che si tratti di piccole molecole chimiche o complesse biomolecole come anticorpi monoclonali e proteine ricombinanti, determinarne le costanti di associazione, dissociazione ed affinità è indispensabile in tutte le fasi identificazione, generazione e ottimizzazione di hit e lead.

Tecniche label-free e in real-time, come la Surface Plasmon Resonance, forniscono un valido supporto analitico per la caratterizzazione di questi parametri. Nonostante questo, diversi artefatti affliggono le strumentazioni SPR tradizionali, rendendo estremamente difficile una precisa ed accurata caratterizzazione delle costanti. In particolare, interattori deboli ed elevati rapporti tra i pesi molecolari di ligando e analita possono complicare molto il disegno sperimentale e portare a risultati poco robusti ed incerti. In particolare, bassa risoluzione nella caratterizzazione delle costanti di dissociazione e il fenomeno della limitazione al trasporto di massa, sono i due principali nemici di dati accurati, robusti e privi di falsi positivi.

I sistemi WAVE di Creoptix, grazie alla tecnologia proprietaria GCI (Grating-Coupled interferometry) e ad una innovativa microfluidica integrata sul chip garantiscono la più alta sensibilità del mercato consentendo analisi accurate anche con segnali molto bassi, e rapidissimi tempi di transizione per l’acquisizione del segnale ad altissima risoluzione.

Nello studio delle interazioni biomolecolari tramite biosensori, la limitazione del trasporto di massa rappresenta una sorgente di errore nella corretta caratterizzazione del sistema. La limitazione del trasporto di massa è causata dalla creazione di un gradiente tra la soluzione bulk e la superficie del sensore, spesso a causa dell’elevata densità di immobilizzazione del ligando necessaria all’ottenimento di un segnale misurabile nei sistemi SPR tradizionali.

I sistemi WAVE sfruttano la tecnologia GCI per aumentare esponenzialmente la quantità di segnale misurato consentendo l’acquisizione di segnali robusti anche con bassi livelli di immobilizzazione o nel caso in cui il ligando sia poco attivo. Questo si traduce nella possibilità di ottenere cinetiche attendibili anche con valori di Rmax < 1. In queste condizioni, l’effetto della limitazione al trasporto di massa è inesistente o trascurabile. Non sarà quindi necessario utilizzare modelli correttivi per l’analisi dei sensogrammi e allo stesso tempo si risparmierà materiale prezioso non essendo richiesti alti livelli di immobilizzazione.

Figura 1 Sensogrammi ottenuti dall’interazione tra Acetazolamide (222.25 Da) e anidrasi carbonica a diversi livelli di immobilizzazione. L’analisi dei sensogrammi A ha richiesto l’applicazione di un modello in grado di compensare per la limitazione del trasporto di massa mentre il sensogramma B, acquisito con un livello di immobilizzazione molto inferiore, mostra un andamento cinetico del primo ordine e non ha richiesto l’uso di modelli correttivi

L’elevata sensibilità abilita altri vantaggi applicativi come la possibilità di misurare correttamente le cinetiche tra molecole con alto rapporto tra i pesi molecolari. In Fig. 2 si riportano i sensogrammi ottenuti per l’interazione tra due molecole con rapporto tra pesi molecolari di 370. La tecnologia CGI consente di lavorare anche a bassi livelli di loading, preferibili quando si lavora con target ad alto peso molecolare.

Figura 2 Interazione tra una proteina target di 110 kDa e una piccola molecola da 295 Da. Rapporto di MW tra Ligando e analita: 370

Interattori deboli, come quelli che spesso si trovano nello screening di librerie di frammenti, vengono tipicamente classificati sulla base delle affinità piuttosto che per le costanti cinetiche. Questo perché piattaforma SPR tradizionali non dispongono della capacità di misurare correttamente costanti di dissociazione molto rapide. La misura dell’affinità può generare molti falsi positivi allungando il workflow e aumentando i costi.

Grazie all’alta sensibilità analitica e, soprattutto, ad un design proprietario della microfluidica direttamente sul chip, i sistemi WAVE di Creoptix garantiscono i tempi di transizioni più rapidi sul mercato, di soli 150 ms, e un’alta risoluzione dell’acquisizione del segnale, consentendo la caratterizzazione cinetica anche delle interazioni più deboli. In Fig. 3 si riportano i sensogrammi ottenuti dall’interazione tra CAII e methylsulfonamide. Le finestre di zoom sulle fasi di associazione e dissociazione mostrano chiaramente l’altra risoluzione di acquisizione in grado di rilevare curvatura e analizzare quindi correttamente i parametri cinetici con valori di residuale molto bassi.

Figura 3 Sensorgramma di metilsulfonamide (95,1 Da) che si lega all'anidrasi carbonica II (29 kDa) immobilizzata mediante accoppiamento amminico su un WAVEchip PCH a 8500 pg/mm2. I dati sono stati acquisiti a 40Hz con un flusso di 200μl/min. (B) Zoom nella fase di associazione (a sinistra) e la fase di dissociazione (a destra) con i rispettivi grafici di distribuzione residua.

Grazie ai sistemi WAVE di Creoptix è possibile studiare realmente le cinetiche di interazione, senza artefatti e modelli correttivi, e in un ampio range di condizioni sperimentali.

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