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24 Marzo 2020

Andrea Pigozzo

Parte 2 - BioLayer interferometry per Hybridoma e Phage Display Screening

Questo approfondimento in 2 parti illustra come la tecnica BLI per l'analisi degli anticorpi, grazie alla sua versatilità e ampia scelta di chimiche superficiali, consente la messa a punto di esperimenti di caratterizzazione complessi e altamente informativi.  Questa seconda parte si concentra sull’uso della tecnica BLI a supporto dei processi di produzione degli anticorpi. Ti sei perso la prima parte?Clicca qui per leggerla!

La produzione di anticorpi monoclonali avviene principalmente secondo due approcci: lo screening di ibridomi o attraverso tecnologie “innovative” come ad esempio la tecnica Phage Display.
Mediante la tecnica degli ibridomi, gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono generati da cellule B identiche, cloni di una singola cellula madre. A differenza degli anticorpi policlonali (Fig. 7A), che sono prodotti in animali vivi, gli anticorpi monoclonali sono prodotti ex vivo usando tecniche di coltura tissutale. Il processo inizia con l’immunizzazione di un animale, spesso un topo, in seguito all'iniezione dell'antigene desiderato. Una volta che l'animale sviluppa una risposta immunitaria, i linfociti B sono isolati dalla milza dell'animale e fusi con una linea cellulare di mieloma, creando ibridi immortalizzati di mieloma a cellule B. Gli ibridomi così creati, in grado di crescere continuamente in coltura producendo anticorpi, vengono quindi selezionati e caratterizzati per il mAb desiderato in funzione della migliore affinità per il target (Fig. 7B).

Figura 7: Schema del processo di produzione di anticorpi policlonali (A) e monoclonali (B) mediante la tecnologia dell’ibridoma

Differentemente dalla tradizionale tecnologia dell'ibridoma, i nuovi approcci utilizzano tecniche di biologia molecolare per lo screening di repertori molecolari, un insieme di differenti varianti molecolari di strutture proteiche o peptidiche. Si possono realizzare vaste collezioni di peptidi/proteine e sviluppare tecniche selettive che permettono di isolare da queste collezioni ligandi specifici diretti contro target molecolari di interesse.
La tecnica del Phage Display è una delle metodologie maggiormente usate nella costruzione e screening di repertori molecolari ed è basata sull’uso dei fagi filamentosi che infettano Escherichia coli (batteriofagi). È infatti possibile inserire sequenze amminoacidiche codificanti per porzioni di proteine di interesse in regioni “tolleranti” delle proteine strutturali di alcuni batteriofagi, senza alterarne l’infettività virale. Questo comporta l’espressione delle proteine corrispondenti sulla superficie del fago rendendone possibile lo screening dell’interazione rispetto al target e la successiva selezione. 

Figura 8: Rappresentazione di un fago nel cui genoma è incluso un gene codificante per una porzione della regione variabile di un anticorpo la quale viene espressa ed esposta sulla superficie del fago (https://www.biologicscorp.com)

Una volta selezionato un fago in virtù della sua specificità di legame è quindi possibile risalire direttamente al genotipo, semplificando le procedure di clonaggio. Le molecole così selezionate possono poi essere espresse in forma solubile in fusione con opportuni peptidi ‘tag’ che ne permettono una rapida identificazione e purificazione.
La tecnologia del Phage Display ha portato alla costruzione di molti repertori molecolari interamente in vitro, da cui sono stati selezionati anticorpi ad alta affinità. Alcuni di questi repertori sono stati costruiti fondendo oligopeptidi a sequenza casuale. Attraverso una operazione di “setacciamento”, che prevede una serie ripetuta di cicli di selezione, di eluizione e di amplificazione, è possibile isolare fagi che presentano sul capside peptidi in grado di interagire con una specifica proteina bersaglio (Fig. 4).

Figura 9: Schema rappresentativo della tecnologia del phage display 

Anticorpi ricombinanti (rAbs)

Una delle applicazioni di maggior successo del “phage display” è rappresentata dalla costruzione di repertori/librerie di anticorpi ricombinanti. Queste ampie collezioni di varianti anticorpali (nell’ordine di complessità di 108-1010) “mimano” la variabilità del sistema immunitario animale, fornendo la possibilità di selezionare molecole ad alta affinità e specificità in modo molto più semplice, economico ed eticamente accettabile rispetto al sistema classico di isolamento di immunoglobuline attraverso l’immunizzazione di animali.

Figura 10: Frammenti di anticorpi ricombinanti

L’esposizione sulla superficie di fagi filamentosi di frammenti di anticorpi, grazie alla fusione della proteina minore di superficie (pIII) del fago M13, ha fornito un potente mezzo per selezionare anticorpi con predefinite specificità di legame da repertori molecolari di geni codificanti i domini variabili delle immunoglobuline. Partendo da repertori derivati da geni V, provenienti da topi immunizzati e costituiti da combinazioni casuali catena pesante (VH)-catena leggera (Vκ o Vλ), sono stati isolati frammenti anticorpali ad alta affinità di legame. Infatti la variabilità dei repertori anticorpali può essere ulteriormente aumentata mediante riarrangiamenti dei geni in vivo, basata sull’assortimento casuale di geni VH e Vκ o Vλ che favorisce la possibilità di isolare ligandi con buona affinità.

Il principio del “phage display”

Molte differenti tipologie di ligandi (proteine, peptidi, frammenti anticorpali) possono essere clonati nel genoma fagico come fusione con il gene che codifica una proteina fagica di superficie (pIII, pVIII). La scelta della proteina capsidica è dettata principalmente dal numero di copie della proteina di interesse che si vogliono esporre su fago (circa 2700 copie per fago nel caso della pVIII, contro le 5 copie al massimo per fago nel caso della pIII). La fusione con la proteina maggiore di rivestimento permette la selezione di proteine con basse affinità di legame (è questo il caso ad esempio di repertori peptidici espressi su fago), mentre fusioni con la proteina pIII permettono di selezionare proteine dotate di elevate affinità di legame (ad esempio da repertori di esposizione di frammenti anticorpali). Peptidi o proteine di interesse, espresse come prodotti di fusione con le proteine fagiche, sono assemblate nel batterio durante l’infezione ed esposte sulla superficie dei fagi maturi. La connessione tra genotipo e fenotipo del ligando permette l’arricchimento in fagi specifici, mediante la selezione su bersagli molecolari immobilizzati su supporti adeguati (tubi di plastica, membrane, microsfere, ecc...).È possibile anche effettuare la selezione con l’antigene libero in soluzione, ad esempio utilizzando l’antigene biotinilato. Tale strategia permette di selezionare anticorpi che legano l’antigene in soluzione nella sua forma nativa. Solo i fagi che espongono ligandi con affinità per il bersaglio di interesse vengono trattenuti, mentre quelli aspecifici vengono eluiti attraverso lavaggi. I fagi leganti vengono recuperati ed utilizzati per reinfettare batteri che vengono fatti crescere per un ulteriore arricchimento.

Repertori di anticorpi sintetici

Per la costruzione di un repertorio di anticorpi sintetici, i geni codificanti per i domini variabili V, vengono assemblati introducendo variazioni casuali in posizioni definite delle regioni “complementarity determining regions” (CDRs), anse ipervariabili in cui è concentrata la maggior parte della diversità. In particolare le CDR3 occupano una posizione centrale nella formazione del sito di legame e, sulla base di studi di struttura molecolare, è stato dimostrato che queste corrispondono alle regioni maggiormente implicate nel riconoscimento dell’antigene. Questo dato è anche confermato dalla maggior variabilità registrata per le CDR3 degli anticorpi noti, rispetto alle altre CDR, indice questo di maggior adattamento all’epitopo molecolare da riconoscere. Per questa ragione le CDR3 costituiscono il bersaglio principale per introdurre diversità nei repertori sintetici. E’ comunque possibile migliorare l’affinità degli anticorpi ottenuti da una prima selezione, attraverso la successiva modifica casuale delle CDR1 e/o delle CDR2. Questo permette di ottenere nuovi “sotto-repertori molecolari”, da cui è possibile selezionare molecole con maggiore affinità di legame che meglio si adattano all’epitopo riconosciuto.
Altri sistemi per aumentare l’affinità di anticorpi selezionati da repertori prevedono cicli di “chain shuffling” o mutagenesi puntiforme, in modo da ottenere ligandi specifici e con alta affinità, perfino superiore a quella di molecole prodotte da un sistema immunitario. D’altro canto repertori sintetici di più recente costruzione, in virtù dell’uso di tecniche di clonaggio e di sistemi di trasformazione più efficienti, hanno raggiunto livelli di complessità particolarmente alti (vicini a 1010). Questo ha permesso di ottenere anticorpi con ottima affinità anche senza ricorrere ad ulteriori passaggi di miglioramento di affinità. Esistono comunque limiti fisici nell’arricchimento che sono legati alla procedura di selezione e che condizionano sia la grandezza che la diversità genetica di un repertorio.

Soluzioni analitiche offerte dalla tecnologia BLI 

I sistemi Octet consentono uno screening ad alto rendimento di supernatanti di ibridoma grezzi per monitorate i livelli di espressione di mAb e la cinetica di legame. Il sistema non contiene microfluidica, rendendolo robusto e adatto per l'analisi automatizzata di matrici grezze. I tassi di associazione e dissociazione possono essere stimati direttamente dai campioni di supernatante, consentendo l'identificazione precoce dei cloni più promettenti.
Grazie all’ampia selezione di sensori e alla compatibilità con matrici complesse è possibile La quantifica diretta di IgG nei supernatanti dai pozzetti di una singola colonia da progetti di clonazione dell'ibridoma consentendo la selezione delle linee cellulari secernenti le quantità più elevate. Un altro importante aspetto è l’ottimizzazione delle condizioni di coltura cellulare; quando si testano reagenti di coltura come integratori di siero o altri tipi di fattori di crescita, l'analisi rapida della concentrazione di anticorpi è un criterio importante. Grazie alle piattaforme Octet è quindi possibile evitare step di purificazione di affinità su piccola scala di ciascun campione prima dell’esecuzione di test ELISA risparmiando tempo e campione. Inoltre, il sistema Octet può anche essere utilizzato per determinare costanti di affinità. Una volta che è stato sviluppato un anticorpo monoclonale e sono disponibili anticorpi purificati, è possibile eseguire un esperimento cinetico completo sul sistema Octet per determinare l'affinità verso l’antigene1.

Figura 11: (SX) Ranking di affinità di legame per anticorpi da campioni crudi di ibridomi. Antigene immobilizzato tramite coupling amminico. (DX) Analisi cinetica di anticorpi purificati con l’antigene biotinilato immobilizzato su sensori a streptavidina.

Grazie al suo design ad alta produttività, il sistema Octet viene utilizzato di routine come piattaforma di screening secondaria per i frammenti Fab e i ligandi non-anticorpali derivati dalle librerie fagiche. Usando l'antigene immobilizzato, un esperimento Octet può fornire dati di classificazione di affinità e stime delle costanti di associazione e dissociazione per ogni hit primario.

 

Figura 12: Sensogrammi BLI ottenuti da lisati cellulari di E. coli contenenti Fab specifici contro GFP immobilizzata sul sensore

Grazie alle piattaforme Octet è possibile misurare velocemente i tassi di dissociazione degli anticorpi presenti in lisati cellulari, consentendo così la classificazione dei cloni positivi ottenuti da screening primari basati su test ELISA. Con questa ulteriore classificazione, gli anticorpi con bassi tassi di dissociazione possono essere identificati e selezionati per un'ulteriore caratterizzazione. L'elevato throughput delle piattaforme Octet consente di eseguire questi studi in modo economicamente vantaggioso ed efficiente. Questa tecnologia di analisi Dip e Read™ è utile per eseguire misure nei lisati grezzi e grazia al basso costo dei sensori non è necessaria la loro rigenerazione consentendo di eseguire i test senza la necessità di anticorpi di controllo. Questa fase secondaria di screening per la riduzione della diversità degli anticorpi arricchiti in base al loro tasso di dissociazione è una potente estensione del processo di generazione di anticorpi. Facilita la classificazione degli anticorpi per la successiva selezione e l'ulteriore caratterizzazione, consentendo l'identificazione degli anticorpi con le proprietà di legame migliori o desiderate.

[1] Use of the Octet QK System to Enhance Service in a Core Hybridoma Laboratory – Application Note 1

www.uniroma2.it/didattica/Immunotecnologia/deposito/Lezione1.doc
Stefan Harth e Francisco Ylera, Off-Rate Screening of HuCAL® Antibody Phage Display Selections Using the FortéBio Octet® RED384 (AbD Serotec)

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