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14 Gennaio 2019

Andrea Pigozzo

Sviluppo di processo e Manufacturing di biofarmaci: BLI come tecnica di controllo

Tecniche analitiche in grado di misurare la qualità e la quantità di proteine sono impiegate in quasi tutti gli stadi di ricerca, sviluppo di processo e produzione di biofarmaci. Tecniche come la spettroscopia UV, ELISA e HPLC sono state impiegate per anni in queste applicazioni e continuano ad essere le tecniche di riferimento nonostante le note limitazioni. Per la caratterizzazione dell’attività funzionale di proteine terapeutiche le tecniche label-free basate su biosensori trovano sempre maggior impiego in quanto in grado di rispondere alle sempre più stringenti esigenze di economia ed efficacia delle varie fasi di sviluppo.

Tra queste la Bio-Layer Interferometry è stata adottata entusiasticamente da numerose aziende farmaceutiche per la sua facilità d’uso ed estrema versatilità (Figura 1).

pipe-line biofarmaceutica

Fig. 1 Applicazioni della tecnica BLI nella pipe-line biofarmaceutica

La Bio-Layer Interferometry (BLI) è una tecnologia label-free per la misura delle interazioni biomolecolari. È una tecnica analitica ottica che analizza il pattern di interferenza della luce bianca riflessa da due superfici: uno strato di proteina immobilizzata sul tip di un biosensore e uno strato di riferimento interno (Figura 2).

STRATO INTERNO

Fig.2

Il legame tra un ligando immobilizzato sulla superficie della punta del biosensore e un analita in soluzione produce un aumento dello spessore ottico alla punta del biosensore, che si traduce in uno spostamento di lunghezza d'onda, Δλ (Figura 3). Questo rappresenta una misura diretta della variazione di spessore dello strato biologico. Le interazioni sono misurate in tempo reale, fornendo la capacità di monitorare specificità del legame, tassi di associazione e dissociazione, o concentrazione, con precisione e accuratezza.

Solo le molecole che si legano o si dissociano dal biosensore possono modificare il pattern di interferenza e generare un profilo di risposta. Le molecole non legate, le variazioni dell'indice di rifrazione del mezzo o le variazioni di portata non influenzano il pattern di interferenza. Questa è una caratteristica unica della tecnica BLI che ne estende la capacità consentendo di eseguire misure in campioni grezzi o dopo un minimo trattamento.

Fig. 3

La tecnica BLI implementata sulle piattaforme OCTET risulta una soluzione efficiente e conveniente per lo screening delle condizioni di espressione. Nella selezione dei cloni, migliaia di ibridomi possono essere analizzati per la verifica del legame e il livello di secrezione delle proteine. Allo stesso modo, nello sviluppo delle condizioni di coltura cellulare è possibile monitorare gli effetti delle variazioni di nutrienti o altre proprietà del bioreattore.

La concentrazione di anticorpi e proteine ​​può essere determinata in matrici grezze, come lisati cellulari o supernatanti di ibridoma, risparmiando tempo e risorse durante l'elaborazione di un numero elevato di campioni nel caso del sistemi automatizzati OCTET. Nei test quantitativi, il range dinamico di oltre due ordini di grandezza consente di utilizzare un singolo dosaggio di quantifica in tutte le fasi di sviluppo: dalla coltura cellulare iniziale ai bioreattori di produzione. Analizzati con un metodo non distruttivo i campioni sono totalmente recuperabili. Questo costituisce un vantaggio fondamentale quando si lavora con bassi volumi di campioni e campioni preziosi.

Allo stesso modo, la tecnica BLI trova largo impiego in tutte le fasi di downstream (Figura 4) come, ad esempio, nella determinazione della Dynamic Binding Capacity (DBC) delle colonne di affinità cromatografica, nello studio delle condizioni di binding, lavaggio ed eluizione e nell’analisi dei contaminanti.

Fig. 4

I processi di purificazione downstream devono rimuovere le proteine delle cellule ospiti (HCP), la proteina residua A e le impurità residue del DNA. Secondo le indicazioni delle autorità di regolamentazione, le HCP in un prodotto farmaceutico dovrebbero essere "al di sotto dei livelli rilevabili utilizzando un metodo analitico altamente sensibile" e, di norma, questo livello non dovrebbe superare i 100 ppm. Il tipo di saggio analitico richiesto per la determinazione delle HCP dipende dalla fase dello studio clinico per il quale è prodotto il prodotto. Per le fasi cliniche iniziali, un saggio generico può essere sufficiente. Tuttavia, un test specifico per le HCP è generalmente richiesto per gli studi di fase 3 e successivi.

Un altro contaminante di grande interesse nello sviluppo di processo è la proteina A residua, rilasciata dalle colonne in fase di purificazione. L'eluizione degli anticorpi durante cromatografia a proteina A richiede condizioni acide che a loro volta possono accelerare la lisciviazione della proteina A dalla colonna. I livelli di Proteina A residua non devono superare 10 ppm nel prodotto finale del farmaco. Test per l’ottimizzazione del processo di determinazione della proteina residua A e la titolazione del prodotto possono essere completamente automatizzati su sistemi Octet 384 utilizzando anche piattaforme di liquid handling esterne. Il saggio Octet per la proteina A residua è altamente sensibile con un LLOQ di 0,20 ppm e un intervallo dinamico > 2,5 log. Inoltre, è molto più veloce rispetto ai metodi concorrenti. Un dosaggio di Proteina A residua sul sistema Octet RED384 può essere completato in 1 ora e 45 minuti per piastra con un coinvolgimento minimo dell'analista, rispetto a un minimo di 3,5 ore per ELISA (incluso un tempo di hands-on significativo).

I sistemi Octet forniscono test di quantifica robusti e altamente riproducibili per la determinazione della concentrazione di proteine ma anche per la verifica dell’attività funzionale e sono adatti per il loro impiego in ambienti di controllo qualità grazie alla conformità GxP. Inoltre, la loro facilità d’uso ne consente una rapida ed efficiente implementazione in qualsiasi flusso di lavoro rendendo questa tecnologia uno strumento veramente trasversale lungo tutta la pipeline di ricerca e sviluppo biofarmaceutica.

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