La stabilità delle proteine è un aspetto critico nello sviluppo di bioterapie. Tecniche tradizionali sono spesso lente, frammentate e richiedono grandi volumi di campione.

La piattaforma Aunty, sviluppata da Unchained Labs, è la prima piattaforma su piastra in formato SBS da 96 pozzetti che combina fluorescenza full-spectrum, scattering statico (SLS) e dinamico (DLS) con un preciso controllo termico che consente lo screening ad altissima produttività di proteine e vettori virali con soli 8 µL per campione.

Tra le funzionalità principali:

• Misura simultanea di Tm (melting temperature) e Tagg (temperatura di aggregazione) anche con traccianti fluorescenti (es. SYPRO Orange, SYBR Gold).
• Studio delle dimensioni e polidispersione delle molecole da 0.3 a 1000 nm.
• Valutazione della stabilità colloidale (kD, B22, G22).
• Screening isotermico fino a giorni interi, con dati SLS, DLS e fluorescenza.
• Analisi di stabilità dei vettori virali (es. AAV) tramite monitoraggio della fuoriuscita del genoma.

Uno dei segreti alla base di queste prestazioni è la piastra Aunty, la prima piastra da 96 pozzetti in formato SBS in quarzo per garantire una qualità ottica e una compatibilità biochimica senza precedenti.

Figura 1 Piastra Aunty

Tutto quello che è necessario fare è caricare 8 uL di campione e sigillare la piastra per evitare contaminazione. Il sistema è compatibile con concentrazioni tra 25 ug/mL e 300 mg/mL che possono essere analizzate anche simultaneamente sula stessa piastra.

Il controllo termico è selezionabile tra 15 e 95 °C e le rampe sono configurabili tra 0.1 e 10 °C/min. Allo stesso tempo è possibile eseguire esperimenti in isotermia per ore o giorni per lo studio della stabilità a lungo termine.

Analisi di fluorescenza a spettro completo, SLS e DLS possono essere eseguite insieme o singolarmente, su uno o più campioni. La flessibilità analitica è tale da poter costruire il disegno sperimentale perfetto e ottenere le informazioni necessarie per lo studio di stabilità di costrutti, coniugati, o “semplicemente” testare diverse formulazioni.

In questa approfondita nota applicativa è possibile entrare nel dettaglio di ciascuna funzionalità con esempi applicativi mirati:

1. Rampe termiche per la determinazione della temperatura di denaturazione (Melting Temperature, Tm) e della temperatura di aggregazione (Tagg) con o senza caratterizzazione dimensionale
2. Rampe termiche con coloranti per quelle molecole che non presentano fluorescenza intrinseca
3. Stabilità colloidale per la determinazione di parametri cruciali nello screening formulativo come kD, B22 e G22
4. Stabilità isotermica
5. Stabilità di capside virale

Nel caso dell’applicazione dedicata alla rampa termica con SLS e DLS si sfruttano al massimo le potenzialità della strumentazione. La rilevazione combinata di SLS e DLS permette infatti di elucidare sinergicamente dinamiche legate alla stabilità mediante tecniche ortogonali in un unico strumento.

Nell’esempio riportato in Fig. 2B, l’incremento del segnale DLS avviene a partire da circa 80 °C ed è limitato a soli 5 nm. Le dimensioni raggiunte non sono confrontabili a quelle tipiche degli aggregati proteici, che sono più frequentemente comprese nell’ordine di centinaia di; è quindi probabile che l’aumento di dimensioni riportato, che coincide strettamente con la Tm2, sia dovuto alla denaturazione della proteina e non alla sua aggregazione.

Figura 2 NISTmAb diluito a 1 mg/mL in 12,5 mM di L-istidina, 12,5 mM di istidina-HCl, pH 6,0 ed analizzato utilizzando l’applicazione Tm & Tagg di Aunty con impostazioni predefinite. Le Tm (A, linee verticali) sono state determinate dalle variazioni della fluorescenza BCM (asse y sinistro, punti verdi) in base ai picchi del differenziale del primo ordine (asse y destro, linea tratteggiata). La tabella a lato mostra le Tm medie di Aunty e di DSC pubblicate, più o meno la deviazione standard. I diametri medi Z (B) della proteina durante la rampa termica sono stati determinati insieme alla fluorescenza.

La combinazione accurata di una rilevazione multi-parametrica consente di comprendere meglio e più velocemente le dinamiche associate alla stabilità del sistema oggetto di studio. Grazie all’elevata prestazione dell’hardware che combina un rapidissimo, ma allo stesso tempo preciso, movimento della piastra con una ottimizzata raccolta del segnale luminoso per una lettura in fluorescenza più rapida ed un nuovo correlatore per misure DLS ed SLS altrettanto veloci, è possibile ottenere risultati ad altissimo contenuto informativo con read-out di fino a 96 campioni al minuto.