La microcalorimetria a scansione differenziale (DSC) è una tecnica assoluta di caratterizzazione biofisica estremamente informativa, tanto da essere ritenuta il “gold standard” nell’analisi della stabilità proteica.

La tecnica si basa sulla misura del calore assorbito dal campione sottoposto ad una rampa termica. Quando la molecola, o la miscela di molecole, all’interno della cella campione si scalda inizia il processo di denaturazione, a cui corrisponde un assorbimento di calore misurato come gradiente tra la cella di analisi e quella di riferimento. Questo genera un profilo come riportato in Fig. 1 dal quale è possibile ricavare diversi parametri termodinamici descrittori del processo.

Figura 1 Principio di funzionamento

Tra questi, il parametro più utilizzato è sicuramente la Tm che rappresenta la temperatura alla quale il 50% della biomolecola è denaturata ed è un importante indicatore di stabilità. Molto informativi sono però i numerosi parametri termodinamici che è possibile ricavare direttamente da un termogramma in grado di descrivere e comprendere il meccanismo di azione del processo di denaturazione come, ad esempio, ΔCp, ΔHcal, ΔT1/2 o ΔHVH.

ΔHcal corrisponde all’energia totale assorbita dal campione necessaria per la transazione da stato nativo e denaturato.  Confrontata con ΔHVH permette di comprendere meglio il meccanismo di denaturazione. Ad esempio, quando ΔHVH< ΔHcal significa che il processo di denaturazione attraversa degli stati intermedi e che quindi sono presenti dei domini indipendenti che generano transizioni distinte.  Il loro rapporto invece consente di determinare un parametro chiamato unità cooperativa: tanto è maggiore tanto più la transizione è cooperativa ovvero, in altre parole, le molecole si coordinano a vicenda per ottenere un nuovo grado di libertà: quando una molecola assorbe energia, altre molecole vicine trovano più facile raggiungere il nuovo stato.

Le applicazioni principali della microcalorimetria DSC sono focalizzate sullo studio dei bioformulati, la valutazione comparativa di diversi costrutti biomolecolari e lo studio degli effetti di mutazioni nella stabilità proteica. L’elevato contenuto informativo dei termogrammi DSC consente però di espandere notevolmente gli ambiti applicativi di questa potente tecnica. Ad esempio, l’analisi DSC dei fluidi biologici è un’area emergente con applicazioni che si estendono fino alla diagnostica clinica.

I fluidi biologici sono infatti una miscela complessa di proteine (oltre 3.000 nel plasma) il cui studio a scopo clinico spesso richiede analisi laboriose e complesse. Al contrario, i profili DSC sono sensibili alle variazioni delle proprietà termiche di queste proteine come conseguenza di innumerevoli fattori, anche molto complessi, associati allo stato clinico del paziente.¹

Nell’applicare la DSC alle proteine del siero del sangue, si confrontano in genere le curve di denaturazione ottenute per un paziente malato con il profilo atteso per gli individui sani. Le alterazioni correlate alla malattia delle proteine del siero forniscono una informazione diagnostica evidente sulla curva DSC.

Questo approccio diagnostico è stato applicato in svariati settori clinici come quello oncologico, per il monitoraggio dello stato di avanzamento della malattia fino al controllo dell’efficacia di terapie antitumorali[2], nella medicina dello sport[3] e in patologie gastriche e polmonari.

Figura 2 Curve DSC ottenute per campioni di siero di sangue da pazienti trattati con chemioterapia con ridotta progressione (n = 8) e individui sani (n = 5)².

La differenza nei termogrammi tra individui normali e malati non è causata da cambiamenti radicali nelle concentrazioni delle proteine plasmatiche più abbondanti, ma sembra piuttosto derivare dall’interazione di biomarcatori, non necessariamente conosciuti, con le principali proteine del campione in oggetto. Questi risultati indicano un nuovo promettente utilizzo della calorimetria come strumento diagnostico.⁴

Figura 3 Termogrammi di campioni di plasma da individui malati. Ogni pannello confronta il plasma normale (ombreggiatura magenta) con plasma malato (ombreggiatura azzurra). Il termogramma medio è mostrato come una linea continua; l’ombreggiatura indica la deviazione standard. (A) Plasma da individui con lupus sistemico. La media è stata ottenuta da quattro termogrammi, duplicati di DSC eseguiti su campioni di due individui malati. (B) Plasma da individui con malattia di Lyme. La media è stata ottenuta da otto termogrammi, duplicati di DSC eseguiti su campioni di quattro individui malati. (C) Plasma da individui con artrite reumatoide. La media è stata ottenuta da 10 termogrammi, duplicati di DSC eseguiti su campioni di cinque individui malati.

L’applicazione della microcalorimetria DSC in ambito diagnostico è estremamente promettente: studi analitici molto complessi infatti possono essere potenzialmente ridotti ad un “semplice” confronto di termogrammi DSC consentendo di ridurre notevolmente i tempi di diagnosi.

¹ Garbett, N. C., Mekmaysy, C. S., DeLeeuw, L. & Chaires, J. B. Clinical application of plasma thermograms. Utility, practical approaches and considerations. Methods 15, 41–50 (2015).
² Karolina Kędra-Królik, Izabela Chmielewska, Anna Michnik & Piotr Zarzycki, Blood Serum Calorimetry Indicates the Chemotherapeutic Efficacy in Lung Cancer Treatment. Scientific Reports, volume 7, Article number: 16796 (2017)
³ Michnik, A. et al. DSC serum profiles of sportsmen. J Therm Anal Calorim 113, 365–70 (2013)
⁴ Garbett, N. C., Miller, J. J., Jenson, A. B. & Chaires, J. B. Calorimetry outside the box: a new window into the plasma proteome. Biophys. J. 94, 1377–1383 (2008).