La terapia genica si basa sull’abilità di modica del genoma di una cellula target, inserendo nuovi geni o sostituendo o inattivando geni che causano malattie.

I lentivirus sono retrovirus a lenta replicazione, derivati dal virus HIV-1, e sono generalmente impiegati come vettori nella terapia genica data la loro capacità di integrarsi nel genoma ospite con un’alta efficienza di trasduzione.

L’infezione da lentivirus raramente genera proteine immunogeniche e può trasportare anche grandi quantità di informazione genetica estendendo significativamente il campo di applicazioni. Inoltre, la possibilità di ingegnerizzare proteine specifiche nell’envelope virale abilita la capacità di colpire cellule specifiche o tessuti.

Figura 1 Rappresentazione schematica di un Lentivirus

Determinare il titolo virale di una preparazione è fondamentale per definirne la qualità e stimare la quantità di vettore richiesta per la trasduzione.

Molte tecniche attualmente utilizzate sono limitate in termini di sensibilità e forniscono scarse informazioni di qualità. Ad esempio, alcune sono limitate a campioni purificati mentre altre non consentono di correlare l’informazione dimensionale con l’analisi proteomica.

Nanoview ha sviluppato una tecnologia che consente la determinazione dei lentivirus a tutti gli stadi del processo di purificazione e che collega l’informazione proteomica con quella fisica/dimensionale.

La tecnica, già ampiamente impiegata per la caratterizzazione dimensionale e fenotica delle vescicole extracellulari , si basa sulla immuno-cattura dei virus sulla superficie di un chip (Fig. 2) per poi misurarne le varie caratteristiche fisiche (dimensione e numerosità) così come proteine superficiali o interne. Dalla combinazione di queste informazioni è possibile caratterizzare le sub-popolazioni così come lo stato di aggregazione.

Figura 2 Rappresentazione di un chip LentiView con la configurazione degli anticorpi di cattura

Tra i principali vantaggi della tecnologia LentiView™ si evidenzia:

• Misura fisica del titolo virale senza necessità di purificazione
• Misura ad alta sensibilità, anche in matrici complesse, fino a 106 VP/mL
• Misura del capside per discriminare virus carichi e non carichi (full/empty)
• Misura simultanea della dimensione dei virus, delle proteine virali e marcatori del capside
• Misura quantitativa di molecole target ingegnerizzate nel vettore (pseudotype profiling)
• Misura di particelle contaminanti, frammenti ed aggregati che risultano co-purificati

Quantifica full vs empty

Uno degli strumenti più comuni per determinare il titolo virale è il test ELISA p24 che misura la concentrazione della proteina p24 costituente il capside. Questo approccio risente di alcuni artefatti come la presenza di p24 in soluzione, lo stato di aggregazione del sistema e l’incapacità di questo approccio di discriminare le particelle virali che mancano del capside, causa di scarsa efficienza di trasduzione.

Lo schema sperimentale (Fig. 3) sfrutta la co-localizzazione dei segnali. Una volta catturate tramite un anticorpo anti-VSV G, le particelle virali sono marcate con delle sonde fluorescenti specifiche anti-VSV-G e anti-p24. La contemporanea localizzazione dei segnali consente di discriminare le particelle con capside da quelle senza capside e quindi caratterizzarle singolarmente per determinarne dimensione (Fig. 4) ed altre proprietà. La piattaforma analitica consente la co-localizzazione di fino a 5 marker (di cui 4 in fluorescenza) per una flessibilità sperimentale veramente ampia.

 Figura 3 Schema del disegno sperimentale per la caratterizzazione full/empty. A dx immagine rappresentativa di una analisi a doppio colore.

Figura 4 Caratterizzazione dimensionale di vettori virali con e senza capside

Questo approccio analitico può essere facilmente declinato a svariate altre applicazioni come la caratterizzazione dello pseudotipo o la rilevazione dei frammenti. La pseudotipizzazione è un processo che consiste nella produzione di vettori virali in combinazione con differenti proteine d’envelope; con questo metodo, l’uso di proteine d’envelope di diversa origine permette di modificare il tropismo del vettore o aumentarne/diminuirne la stabilità (Fig. 5).

Figura 5 Rappresentazione schematica di un esperimento LentiView con la caratterizzazione dello pseudotipo (ETL) e la correlazione con l’efficienza di trasduzione