Originariamente, si pensava che le cellule non in diretto contatto tra di loro comunicassero principalmente tramite molecole solubili come fattori di crescita, chemochine e ormoni. Con il progredire della ricerca, la nostra conoscenza della comunicazione intercellulare è cambiata fondamentalmente. Le cellule possono comunicare con le cellule vicine o distanti secernendo vescicole extracellulari in maniera controllata [1]. Le cellule rilasciano un gruppo eterogeneo di piccole vescicole extracellulari (EVs, <200mm in diametro) di origine endosomiale e della membrana plasmatica, denominate rispettivamente sia esosomi sia microvescicole (MV). Gli esosomi sono derivati dal sistema endosomiale e corrispondono a vescicole intraluminali (ILV) di corpi multivescicolari (MVB). I MVB si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano le loro ILV come esosomi nell’ambiente extracellulare. Al contrario, le MV si staccano dalla membrana plasmatica [1].
In principio, le EVs erano considerate come veicoli per lo smaltimento dei rifiuti cellulari [4]. Con la scoperta che gli esosomi derivati dai linfociti B possono innescare l’attivazione di linfociti T [5] è diventato chiaro che le EVs hanno una funzione regolatoria per la comunicazione intercellulare. Queste vescicole trasportano una composizione unica di macromolecole come lipidi, proteine e acidi nucleici che dipendono dalle caratteristiche delle loro cellule madri. Si presume che al momento dell’interazione con le cellule bersaglio, le EVs vengano internalizzate dalle cellule recipiente, e come conseguenza dell’assorbimento delle Evs, alterino il comportamento cellulare [6,7]. L’involucro delle EVs consiste in un doppio strato lipidico che integra una varietà di marcatori superficiali. Questi marcatori includono tetraspanine, integrine, proteoglicani e altre proteine transmembrana e associate alla membrana. Cambiamenti nella loro composizione possono influenzare l’attività e la funzionalità delle EVs [6,8]. Quindi, le EVs sono una complessa collezione di differenti biomolecole la cui composizione riflette le proprietà biologiche delle loro cellule madri. Pertanto, le EVs hanno generato grande attenzione come agenti terapeutici e biomarkers per malattie particolari [9-12]. Per fare progressi in questo campo, la conoscenza di diversi fenotipi di EVs è un grande valore per sviluppare un appropriato approccio terapeutico. Una caratterizzazione completa della composizione della superficie a livello di singola EV è ancora carente a causa delle sfide tecniche legate all’analisi di piccole vescicole [13].
Con la maggioranza delle EVs che hanno un diametro compreso tra 30 e 100 nm [14], le Evs sono troppo piccole per essere analizzate con convenzionali tecnologie come la citometria di flusso [13]. Conseguentemente, le Evs sono caratterizzate maggiormente dalla microscopia elettronica, tipicamente grazie alla microscopia a trasmissione elettronica (TEM), come è avvenuto negli studi sui reticolociti e sui linfociti B citati in precedenza [5,15,16]. Negli ultimi decenni, gli studi sulle EVs si sono concentrati principalmente nello studio di campioni preparati con differenti tecniche di centrifugazione. Queste EVs isolate sono state analizzate come omogenati mediante tecnologie molecolari come western blot o con diversi approcci omici [17,18]. La prima tecnologia considerate in grado di analizzare le EVs al singolo livello vescicolare è stata la nanoparticle tracking analysis (NTA). Nel 2011, questa tecnologia è stata introdotta per quantificare e misurare la grandezza degli esosomi [19,20]. Tuttavia, le informazioni ottenute con una analisi NTA convenzionale possono essere mal interpretate, perché non è in grado di distinguere tra EV e contaminanti non vescicolari, come gli aggregati proteici [21].
Finora è mancata una panoramica delle diverse caratteristiche delle singole popolazioni di EVs e gli studi hanno caratterizzato le EVs in base alle loro dimensioni, alla morfologia, ai marcatori di superficie o, quando possibile, al loro contenuto [22]. In un tentativo di standardizzare la ricerca sulle EVs, le informazioni minime per studi sulle vescicole extracellulari 2018 (MISEV2018) raccomandano di includere informazione sulle proprietà fisiche delle vescicole extracellulari, la loro composizione biochimica e una descrizione dell’origine cellulare e dei metodi di isolamento [2]. Nuove tecnologie sono state sviluppate che permettono un’analisi multipla dell’espressione di proteine di superficie con una risoluzione di una singola EVs [23-25]. Da allora, un controverso dibattito è iniziato su quale tecnologia sia la migliore per caratterizzare popolazioni di Evs. Complessivamente, queste molteplici tecniche sono sia protein-oriented, caso nel quale è necessaria una specifica proteina per il rilevamento, sia size-oriented, in questo caso una dimensione caratteristica per l’analisi. La citometria a flusso a singola particella, come la citometria a flusso di immagini (IFCM), può analizzare le singole sottopopolazioni di EVs dal loro profilo proteico superficiale, come le tetraspanine, ad un’elevata velocità di produzione [21,26,27]. Tuttavia, il limite teorico di rilevamento è di circa 80 nm per le Evs [28].
D’altro canto, l’analisi basata sul sensore di riflettanza interferometrica a singola particella (SP-IRIS), accoppiata alla colorazione di immunofluorescenza, è orientata alla cattura di proteine fenotipo-specifiche e consente di rilevare quasi realmente un singolo evento. Questo permette la quantifica e l’analisi della grandezza delle EVs catturate dagli anticorpi collegati a specifici microchip. Combinando il metodo con il microscopio ottica a fluorescenza, il SP-IRIS basato sulla piattaforma ExoView R100/R200 e Leprechaun, permette simultanee analisi fenotipiche di Evs catturate con anticorpi coniugati con fluorocromo [23,29]. Comparabile alla citometria a flusso, questo sistema permette una analisi diretta delle EVs nei biofluidi. Questo è considerabile un vantaggio sugli altri metodi analitici poiché evita arricchimenti artificiali delle popolazioni di EVs durante il processo di purificazione [30]. Uno studio pubblicato recentemente descrive i vantaggi e gli svantaggi di entrambi i metodi [28]. Mentre la citometria a flusso risponde alle esigenze di alta produttività, l’immunocattura fornisce probabilmente un profilo di espressione proteica più olistico grazie alla capacità di visualizzare particelle più piccole e di rilevare target con livelli di espressione bassi [28,29,31]. Curiosamente, entrambi i metodi sembrano influenzare il profilo di tetraspanina determinato, che è causato da una varietà di tecniche differenti che amplificano i segnale di sottofondo. Per questo è importante considerare queste limitazioni quanto ci si orienta su un metodo di caratterizzazione [28]. Nel complesso, le tetraspanine CD9, CD63 e CD81 sono generalmente considerate marcatori classici delle EVs [32,33].
Negli ultimi anni, diversi studi hanno mostrato come le EVs di diversi tipi di cellule hanno differenti combinazione e quantità di queste proteine sulla loro superficie [34,35]. Abbiamo supportato questi risultati con la caratterizzazione del fenotipo sEV da cellule di cancro al polmone (NSCLC). Le popolazioni di sEV dei sottotipi NSCLC di adeno e carcinoma a cellule squamose mostrano l’espressione distinta e la colocalizzazione di CD9, CD63 e CD81 a livello di singolo sEV. Abbiamo ulteriormente dimostrato che tra queste, le popolazioni individuali di EVs sono altamente eterogenee [36]. Per ottenere informazioni migliori sulla complessità e eterogeneità abbiamo esteso queste analisi e creato una libreria di fenotipi EVs secreti da diverse tipologie di cellule, incluse le VE terapeuticamente rilevanti da cellule staminali mesenchimali/stromali (MSC) e da cellule endoteliali. Questo studio fornisce una panoramica unica delle caratteristiche cellulari specifiche delle popolazioni di EVs basata sui loro fenotipi CD9/CD63/CD81 analizzati con la piattaforma ExoView R100.
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