La caratterizzazione delle particelle presenti nelle formulazioni bioterapeutiche è oggi un argomento di particolare interesse. La USP <788>1 richiede la classificazione delle particelle in due categorie dimensionali: più grandi di 10 μm e maggiori di 25 μm. La versione più recente di USP <787>2 (e <1787>) ha esteso le raccomandazioni per includere dimensioni inferiori a 10 μm. Questo intervallo di dimensioni inferiori ha attirato una notevole attenzione da parte della FDA a causa delle preoccupazioni sulla risposta immunogenica relativa agli aggregati proteici, sulla riduzione dell’efficacia del prodotto e sulla sicurezza generale.
La microscopia ottica è spesso utilizzata per caratterizzare il particolato presente nelle formulazioni bioterapeutiche, fornendo le loro dimensioni, forma e caratteristiche di trasparenza, e consentendo la loro classificazione in categorie distinte: aggregati proteici, olio di silicone, vari contaminanti Tuttavia, la capacità di un microscopio di fornire un’identificazione esplicita di una particella è limitata alle immagini bidimensionali che raccoglie. L’aggiunta della spettroscopia Raman ad un sistema di microscopia automatizzato fornisce un solido metodo di identificazione primaria per la verifica della natura chimica delle particelle. Associate in un unico sistema, le due tecniche offrono il potenziale per quantificare, caratterizzare e identificare il particolato nelle formulazioni native, così come su un filtro. Il Morphologi 4-ID ha la capacità unica di associare tutti i vantaggi dell’Analisi Automatizzata d’immagine fornita dal Morphologi 4 all’identificazione chimica delle singole particelle con spettroscopia Raman – il tutto in un’unica misura misura MDRS® (Morphologically-Directed Raman Spectroscopy).
Nella nota applicativa scaricabile al link qui in basso viene descritto l’uso del Morphologi ID con spettroscopia Raman (MDRS®) per identificare e caratterizzare il particolato presente in un campione di lisozima e confrontare le particelle sospese in cella ad umido o catturate su un filtro. Due differenti soluzioni di lisozima, preparate a 100 mg/mL e pH 7.1, sono state stressate per produrre aggregati: la prima è stata mescolata rapidamente a temperatura ambiente per 16 ore e usata per l’analisi su filtro, mentre l’altra è stata mescolata rapidamente a 45°C per 4 ore ed analizzata tal quale, allo stato di sospensione.
Analisi su filtro
Sono state rilevate oltre 4000 particelle, classificate poi in 4 gruppi:
-particelle piccole da 2 a 10 μm
-particelle medie da 10 a 25 μm
-particelle grandi con dimensione superiore a 25 μm
-sfere di lattice di dimensione pari a 40 μm aggiunte alla soluzione come riferimento
Sono stati effettuati gli spettri Raman di diverse particelle per ogni gruppo, consentendo d’identificare le particelle come particella proteica, sfera di lattice o particella di gomma (contaminante).Queste analisi dimostrano la capacità del Morphologi ID di identificare particelle subvisibili su un filtro, anche nel caso di materiali a basso scattering come gli aggregati proteici.
Fig.1 Immagini di particelle rappresentative di ogni gruppo di dimensione nel campione di lisozima sul filtro. Va notato che la scala non è la stessa per tutti i gruppi
Fig.3 Spettri Raman rappresentativi ottenuti dal campione di lisozima su filtro: spettro di background del filtro (nero), aggregati di lisozima (blu), sfere di polystyrene latex (in rosso). In verde lo spettro di una particella di gomma rilevata nel campione
Analisi in sospensione
I risultati dell’analisi morfologica per il campione in sospensione sono stati raggruppati, come per l’analisi precedente, in base alla dimensione delle particelle: da 2 a 10 μm (piccolo), 10-25 μm (medio) e più grande di 25 μm (grande).
Fig.4 Selezione di immagini per ogni gruppo definito per il campione di lisozima in sospensione. La scala non è la stessa per tutti i gruppi
Il conteggio delle particelle è notevolmente superiore per il campione in sospensione rispetto al campione su filtro, sono state rilevate più di 90.000 particelle.
Sono state inoltre rilevate differenze di morfologia tra le particelle che suggeriscono diversi meccanismi di aggregazione per i 2 campioni.
L’analisi Raman è stata effettuata su una serie dei grandi aggregati, 25 particelle.
