Sviluppo e produzione di biofarmaci

Il mercato biofarmaceutico è in costante crescita: valutato circa 218 miliardi di dollari nel 2017, prevede di registrare un incremento di circa l’8,59% durante il periodo di proiezione, 2018-2023^a (Figura 1). I prodotti biofarmaceutici includono anticorpi monoclonali, fattori di crescita ricombinanti, proteine purificate e ricombinanti, ormoni ricombinanti, immunomodulatori sintetici, vaccini ed enzimi ricombinanti.

Figura 1 Ricavi relativi di prodotti biofarmaceutici suddivisi per applicazione – Storico e proiezione 2015-2023.

Il sempre maggiore successo di questa categoria di prodotti farmaceutici è legato alla loro capacità di controllare o curare malattie precedentemente non trattabili oltre alla loro maggiore biocompatibilità ed efficacia (Figura 2). Tuttavia, le fasi di ricerca e sviluppo, così come gli elevati requisiti di produzione e la giustamente severa normativa, rallentano la crescita del mercato.

Figura 2 Drivers di mercato e ostacoli per prodotti biofarmaceutici

Dal punto di vista analitico le sfide sono numerose: infatti, la caratterizzazione di una biomolecola terapeutica richiede uno sforzo tecnologico e analitico di gran lunga superiore a quello richiesto per lo sviluppo e la caratterizzazione di una molecola chimica. È facile comprendere il livello di complessità anche solo confrontando le dimensioni di una molecola di acido acetilsalicilico con quelle di un anticorpo monoclonale (Figura 3). Tali differenze trovano riscontro nella sempre maggiore attenzione e se vogliamo severità che le agenzie di controllo stanno ponendo nella regolamentazione dei prodotti biologici in passato forse non sufficientemente caratterizzati. Basti pensare che non sempre è nota con completezza la struttura della molecola e le fasi di produzione così come il ciclo di vita del prodotto stesso possono essere soggetti a fasi critiche non del tutto note o facilmente prevedibili.

Figura 3 Relazione dimensionale tra un principio attivo chimico (acido acetilsalicilico) e una biomolecola terapeutica (anticorpo monoclonale).

Biofarmaci: la necessità di tecniche ortogonali di caratterizzazione

Dalle fasi di ricerca fino allo sviluppo e al controllo di processo risulta quindi fondamentale disporre di tecniche analitiche ortogonali per la conferma delle diverse caratteristiche oggetto di studio. Tale livello informativo diventa ancora più importante nello sviluppo di biosimilari dove è importante caratterizzare la molecola di interesse e allo stesso tempo valutare con estrema accuratezza e sensibilità qualsiasi differenza rispetto al prodotto innovatore. Le seguenti tecniche di caratterizzazione biofisica sono estremamente informative e trasversali a tutto il processo di ricerca e sviluppo permettendo di studiare e monitorare, spesso in condizioni native e label-free, parametri come l’attività rispetto al target anche in matrici complesse (ITC, SPR e BLI), così come lo studio della struttura secondaria e terziaria (Dicroismo Circolare) e definire profili di stabilità (DLS, DSC, SEC):

• ITC Isothermal Titration Calorimentry
• SPR Surface Plasmon Resonance
• BLI BioLayer Interferometry
• DC Dicroismo Circolare
• DLS Dynamic Light Scattering
• DSC Differential Scanning Calorimetry
• SEC Size Exclusion Chromatography

Interazioni e legame

La caratterizzazione avanzata dei profili di interazione e legame è un aspetto fondamentale nella comprensione dei meccanismi d’azione, lo studio della specificità di legame e la stechiometria di interazione.  Studi di interazioni biomolecolari con la tecnica Surface Plasmon Resonance SPR possono essere eseguiti impiegando funzioni di iniezione di nuova generazione come la tecnologia OneStep^® basata sulla teoria della dispersione di Taylor (TDi)^b. Rispetto alle iniezioni tradizionali a concentrazione fissa, l’analisi TDi genera un gradiente di concentrazione dell’analita continuo formato dopo una singola iniezione all’interno di un tubo capillare calibrato prima che il campione entri nel rivelatore SPR. Questo approccio codifica un secondo dominio temporale indipendente in un gradiente di concentrazione dell’analita, che consente l’uso di un’unica curva di legame senza il bisogno di raggiungere lo stato stazionario per ottenere la costante di affinità. Pertanto, rispetto alle iniezioni a concentrazione fissa, la titolazione OneStep^® riduce il tempo richiesto per analizzare un determinato analita ma soprattutto riduce la dipendenza dei parametri l’uno sull’altro e sulla variabilità sperimentale, aumenta il potere risolutivo e informativo permettendo di ridurre il numero di esperimenti necessari alla completa caratterizzazione del sistema. Questo approccio risulta particolarmente importante per l’analisi di interazioni proteina-proteina dove i meccanismi d’azione possono essere complessi ed eterogeneic.

Figura 4 Sensogrammi OneStep rappresentativi per diverse condizioni testate di Fibrinogeno contro zymogen FXIII-A2B2 ricombinante^c.

Altre tecniche, come la BioLayer Interferometry, permettono invece di eseguire studi di interazione biomolecolare anche in matrici complesse e possono trovare interessanti applicazioni nell’ambito del monitoraggio delle terapie basate su biofarmaci consentendo di rivelarne facilmente i livelli in fluidi biologici (ad es. siero) e costruire terapie personalizzate. La tecnica BLI, grazie alla sua estrema versatilità trova largo impiego nello sviluppo di vaccini: grazie alla combinazione di sensori e design sperimentali a matrici è possibile ottenere informazioni dettagliate della cinetica di legame, specificità/affinità, risposte immunitarie, mappatura degli epitopi e del titolo/concentrazione del vaccino.

Figura 5 Rappresentazione pittorica della cattura del virus dell’influenza ad un biosensore a streptavidina (SA) attraverso polimeri di acido sialico biotinilato. 

Stabilità termica

Nell’ambito degli studi di stabilità termica la microcalorimetria DSC è la tecnica di riferimento garantendo un confronto assoluto e robusto dei profili di denaturazione. Grazie all’elevato contributo informativo dei parametri termodinamici assoluti direttamente misurati dal sistema, la tecnica DSC consente di andare oltre il semplice confronto delle temperature di melting dei vari domini presenti, spesso individuati ad elevata risoluzione, ottenendo importanti informazioni legate anche alla High Order Structure (HOS). Grazie agli strumenti DSC più avanzati è inoltre facilmente analizzabile l’effetto di inibitori anche nel caso di interazioni molto forti, fino all’ordine del sub-pM.

Figura 6 Termogrammi DSC per un campione di Avastin in buffer a pH 3.5, 5.0, 5.5, 6.2, e 7.2. (John Carpenter, University of Colorado – MicroCal PEAQ-DSC Automated system)

Strutture secondaria e terziaria – High Order Structure HOS

Le evoluzioni tecnologiche di alcune di queste tecniche come il Dicroismo Circolare hanno di recente reso possibile il loro utilizzo in nuove applicazioni. Ad esempio, la piattaforma Chirascan grazie al suo detector ad altissima sensibilità rappresenta l’unico spettrofotometro di dicroismo circolare in grado di fare studi comparativi oggettivi e statisticamente validati della struttura secondaria e terziaria di biomolecolare. Il Chirascan consente di fornire dati robusti e certi nella validazione di processi, studi di stabilità e nello sviluppo di prodotti biosimilari. La forza di questa tecnologia è stata riconosciuta anche da enti come il NIST che per lo sviluppo e la validazione del primo mAbs standard si appoggerà anche ai risultati forniti dal sistema Chirascan.

Figura 7 Spettri CD in far- e near-UV con elaborazioni statistiche oggettive di confronto dei segnali (Office of Biostatistics and Office of Biotechnology Products, CDER/FDA – Chirascan Q-100)

Conclusioni

Grazie alle recenti innovazioni tecnologiche legate allo sviluppo continuo delle piattaforme di analisi biofisica si è notevolmente esteso l’ambito applicativo di queste tecniche consentendo miglioramenti e velocizzazione di tutte le fasi di ricerca, sviluppo e produzione in ambito biofarmaceutico.

References

^a https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/global-biopharmaceuticals-market-industry

^b Quinn JG. Evaluation of Taylor dispersion injections: determining kinetic/affinity interaction constants and diffusion coefficients in label-free biosensing. Anal Biochem. 2012;421(2):401-410.

^c The Interaction Between Fibrinogen and Zymogen FXIII-A2B2 is Mediated by Fibrinogen Residues γ390-396 and the FXIII-B Subunits. Byrnes J, et al., Blood, 128(15):1969-1978, 2016