In questo approfondimento scopriremo alcune delle nozioni chiave sulla lisi cellulare ovvero il processo di rottura della membrana cellulare, un’applicazione chiave per la tecnologia Microfluidizer®, che Alfatest distribuisce in esclusiva in Italia.

Che cos’è la lisi cellulare?

La lisi cellullare è il processo di dissoluzione o distruzione (altrimenti noto come lisare) di una cellula al fine di recuperare il fluido intracellulare (comunemente indicato come lisato). Una grande varietà di componenti intracellulari possono essere isolati dopo la rottura delle cellule, comprese le proteine e i vettori virali che non sono espressi extracellularmente. La rottura delle cellule è uno step essenziale durante la produzione di molti prodotti biologici come enzimi, acidi nucleici, antigeni per vettori virali e vaccini di nuova generazione o per la terapia genica. La lisi si riferisce specificamente alla rottura della membrana cellulare.

Cosa significa quando una cellula lisa?

La lisi cellulare si riferisce alla rottura di una cellula per accedere al fluido intracellulare, o lisato. Quando una cellula lisa, tipicamente la membrana e/o la parete della cellula viene rotta, permettendo all’operatore che ha lisato la cellula di accedere al lisato.

Quali sono i metodi chimici e termici per la rottura delle cellule?

1.Cicli termici

La lisi cellulare può essere ottenuta anche mediante trattamenti termici (ad es. congelamento-scongelamento e/o trattamenti termici). Nel metodo di congelamento-scongelamento, la sospensione del campione viene sottoposta a più cicli di congelamento in ghiaccio secco e etanolo e quindi scongelamento a temperatura ambiente o 37°C. Poiché le cellule si gonfiano mentre i cristalli di ghiaccio si formano durante il processo di congelamento e si contraggono durante lo scongelamento, le pareti cellulari alla fine cederanno e si romperanno mentre il campione viene sottoposto ripetutamente al processo.

Anche il solo calore può essere utilizzato per lisi cellulare poiché sottoporre campioni di proteine ​​ad alte temperature ne migliora la solubilità e ne aumenta la proprietà emulsionante. L’unico problema risulta nel riscaldamento delle soluzioni proteiche che può rendere più difficile l’estrazione, e provocare la loro denaturazione.

2.Lisi osmotica e chimica

La lisi cellulare può essere facilitata anche sospendendo il campione proteico in soluzione ipotonica (lisi osmotica) e/o utilizzando sostanze chimiche (es. antibiotici, agenti chelanti, detergenti e/o solventi) che possono interagire con alcuni componenti della parete cellulare e consentire alle proteine di fuoriuscire attraverso la parete cellulare. Questi metodi sono idealmente utilizzati per campioni di batteri, lieviti e funghi e comportano il limite di contaminare la preparazione.

Nonostante la loro semplicità questi metodi di lisi presentano numerosi svantaggi, tra i quali una resa piuttosto bassa e un’impossibilità di scalare il metodo su volumi superiori ai vari ml,.

3.Ultrasuoni

In questo metodo, viene utilizzato un trasduttore acustico per fornire onde sonore ad alta frequenza nella sospensione di cellule liquide. L’energia meccanica prodotta nel processo facilita la formazione di bolle microscopiche che, una volta implose, provocano l’irradiazione di onde d’urto in tutto il campione. Tenere il campione immerso in un bagno di ghiaccio e assicurarsi di applicare solo brevi raffiche di onde ultrasoniche per evitare il surriscaldamento. Questo metodo può essere utilizzato per omogeneizzare piccoli lotti (meno di 100 ml) di cellule, batteri, spore e campioni di tessuto finemente tagliati.

4.Omogeneizzazione della pressione

Nell’omogeneizzazione ad alta pressione, i campioni vengono forzati attraverso uno spazio ristretto mentre si applica pressione nel campione. L’estrazione di proteine ​​a pressioni più elevate (40 e 80 MPa) può aumentare significativamente o addirittura raddoppiare il tasso di recupero proteico poiché il processo aumenta efficacemente la disponibilità dell’enzima ai siti di legame. Gli omogeneizzatori ad alta pressione sono anche scalabili in modo da potersi adattare facilmente a campioni di diverse dimensioni e soddisfare l’aumento della domanda.

Quali sono i metodi meccanici per la rottura delle cellule?

I metodi meccanici possono aumentare drasticamente il tasso di recupero proteico, i più comuni utilizzati per la distruzione delle cellule includono l’utilizzo di un processore Microfluidizer®, la macinazione con biglie di vetro (metallo o ceramica), la sonicazione, l’omogeneizzazione ad alta pressione e la French press.

1.Processori Microfluidizer®

Utilizzano una camera d’interazione brevettata a geometria fissa, che contiene un microcanale attraverso il quale la sospensione di cellule viene forzata applicando un’alta pressione che può raggiungere più di 2000 bar (30.000 psi). Si generano all’interno della camera d’interazione sia forze di taglio che forze d’impatto propedeutiche alla lisi delle cellule. I processori Microfluidizer® svilupano una pressione costante, che assicura risultati uniformi e ripetibili. Mentre questo metodo ad alta energia può provocare un aumento di temperatura, grazie ad un controllo efficace della temperatura viene evitata un’eventuale denaturazione del contenuto intracellulare, come confermano la moltitudine di aziende che utilizza i processori Microfluidizer® per la rottura delle cellule e che non rilevano problemi legati alla temperatura.

2.Bead milling

Si tratta di un processo di macinazione tramite piccole sfere, tipicamente fatte di ceramica o di metallo. Tuttavia, questo metodo presenta problemi relativi al controllo della temperatura e alla contaminazione da parte delle sfere stesse.

3.Sonicazione

Questo metodo utilizza le onde ultrasoniche e le forze cavitazionali per rompere la membrana cellulare. Pur essendo un metodo efficiente, sorgono problemi riguardo al controllo della temperatura che può essere molto elevata nelle vicinanze della sonda, e alla scalabilità, molto limitata.

4.Omogeneizzatori ad alta pressione e French press

Sono in genere sistemi basati su valvole, che sfruttano le elevate forze di taglio generate quando le cellule vengono spinte ad alta pressione attraverso la valvola. Questi sistemi consento lo scale-up a volumi elevati, ma il loro principio di funzionamento che dà priorità alla portata volumetrica costante (e non alla pressione costante) può portare a risultati di lavorazione a volte incoerenti.

La French press è simile agli omogeneizzatori ad alta pressione in quanto combina l’alta pressione con una stretta valvola per distruggere le cellule, con la differenza che viene azionata manualmente. Di fatto non è scalabile e non consente un buon controllo della temperatura.