Come ottenere DAR, concentrazione e dimensioni degli ADC con Stunner

Gli ADC stanno bloccando le tue caratterizzazioni ad alto throughput?

Gli antibody-drug conjugates (ADC) possono rappresentare un ostacolo significativo quando si cerca di accelerare la caratterizzazione ad alto throughput. La spettroscopia UV/Vis è il metodo più semplice per determinare la concentrazione di anticorpi e il rapporto farmaco/anticorpo (DAR), ma quando gli spettri di assorbimento UV/Vis dell’anticorpo e del farmaco si sovrappongono, le cose non sono più così semplici. Inoltre, il volume del campione è sempre una risorsa preziosa e gli ADC devono essere analizzati con attenzione per individuare eventuali fenomeni di aggregazione.

La piattaforma Stunner utilizza 2 µL di campione nelle applicazioni dedicate agli ADC per fornire risultati di quantificazione e determinazione del DAR a partire dall’assorbimento UV/Vis per 96 campioni in soli 10 minuti. Stunner può inoltre integrare la diffusione dinamica della luce (dynamic light scattering, DLS) per verificare le dimensioni degli ADC, individuare l’insorgenza dell’aggregazione e completare comunque l’analisi di un’intera piastra in un’ora. Gli algoritmi di unmixing di Stunner gestiscono la sovrapposizione degli spettri di assorbimento UV/Vis di anticorpi e farmaci, consentendo di mantenere una caratterizzazione ad alto throughput. Insegnando a Stunner gli spettri separati dell’anticorpo e del farmaco, lo strumento è in grado di deconvolvere lo spettro di assorbimento complessivo degli ADC (linea nera) nei contributi provenienti dal mAb (linea verde) e dal farmaco o dalla molecola coniugata (linea blu). Nel grafico riportato di seguito vengono mostrati gli spettri di assorbimento totale e deconvoluto di un mAb coniugato con Alexa Fluor™ 350 NHS ester. A partire da questi spettri deconvoluti, Stunner può quantificare la quantità totale di proteina e di carico farmacologico presenti e utilizzarli per calcolare il DAR.

Stunner è pronto a imparare

Per analizzare gli spettri degli ADC con l’UV/Vis, bisogna essere in grado di distinguere lo spettro di assorbimento degli anticorpi dallo spettro del farmaco coniugato. Tuttavia, lo spettro del farmaco può variare significativamente, per questo gli strumenti devono essere abbastanza intelligenti da adattarsi a tali variazioni. Per fortuna Stunner è in grado di apprendere lo spettro di assorbimento di un farmaco da una serie di diluizioni dello stesso farmaco, tramite la funzione Store Analyte.

Per memorizzare gli spettri dell’Alexa Fluor™ 350 NHS ester, le soluzioni a 10 mg/mL in DMSO sono state diluite 1:9 in PBS, in seguito sono state seguite le indicazioni dell’applicazione Store Analyte per creare una serie di diluizioni 2X in un diluente costituito da 90% PBS / 10% DMSO. L’assorbimento della serie di diluizioni è stato misurato con Stunner utilizzando l’applicazione Store Analyte e gli spettri sono stati salvati. Uno spettro del mAb è stato memorizzato secondo la stessa procedura. Questi spettri sono tutto ciò di cui Stunner ha bisogno per la quantificazione degli ADC. Non sono stati necessari ulteriori esperimenti, calcoli o reagenti.

DAR e dimensioni in parallelo

Dopo la coniugazione, l’ADC è stato purificato e il tampone è stato sostituito con PBS mediante Unagi. L’applicazione ADC + Sizing su Stunner ha utilizzato gli spettri del colorante e del mAb salvati in precedenza per determinare in una singola acquisizione la concentrazione, il DAR, la dimensione e l’indice di polidispersità (PDI). Un ADC, misurato in quadruplicato, aveva un DAR di 9,6 con una dimensione media Z di 13,2. Il campione era monodisperso senza evidenza di aggregazione.

Conclusioni

La caratterizzazione degli ADC rappresenta una sfida che può essere complessa tanto quanto la struttura stessa degli ADC. Fortunatamente, Stunner è in grado di quantificare facilmente e velocemente le concentrazioni di anticorpi, il DAR, la dimensione e la distribuzione dimensionale in un formato rapido, a basso volume e ad alto throughput. Stunner è completamente equipaggiato con nuove applicazioni dedicate che rendono la caratterizzazione degli ADC ancora più semplice e veloce.