Abstract

Vescicole extracellulari (EV) e virus condividono tratti distintivi comuni: dimensioni, struttura, biogenesi e assorbimento. Per generare EV che esprimano la proteina spike SARS-CoV-2 sulla loro superficie (S-EV), sono state raccolte EV da cellule SARS-CoV-2 che esprimono le cellule del rene embrionale umano (HEK-293T) mediante transfezione stabile con una codifica vettoriale per le subunità S1 e S2. Le S-EV sono state definite tramite nanoparticle tracking analysis con il Nanosight NS300(Malvern Panalytical) ed  Single-Vescicle Multiparametric Analysis con l’ ExoView(Nanoview Bioscence). Si è ottenuta una popolazione di EV di dimensioni comprese tra 50 e 200 nm. Le EV esprimenti la spike rappresentavano circa il 40% della popolazione di EV totale e della proteina spike co-espressa con le tetraspanine sulle superfici delle EV. Successivamente, si sono utilizzate cellule epiteliali endoteliali e bronchiali ACE2-positive per valutare l’internalizzazione di S-EV etichettate utilizzando un’analisi citofluorimetrica. L’internalizzazione delle S-EV era più elevata di quella delle EV di controllo da cellule non trasfettate. Inoltre, l’assorbimento di S-EV è stato significativamente ridotto dal pretrattamento con anticorpi anti-ACE2. In aggiunta, la colchicina, un farmaco attualmente utilizzato negli studi clinici, ha ridotto significativamente l’ingresso di S-EV nelle cellule. Le S-EV sono un modello semplice, sicuro e scalabile per studiare le interazioni del virus ospite e i meccanismi di nuovi farmaci terapeutici.

Representative nanoparticle tracking analysis of
EVs from H-S cells (S-EVs) and from H-C cells (C-EVs) showing EV size distribution.

Introduzione

L’epidemia della sindrome respiratoria acuta grave_-coronavirus 2 (SARS-CoV-2), che causa il Coronavirus 2019 (COVID-19), costituisce la preoccupazione attuale per la salute a livello globale. I coronavirus (CoV) sono virus con involucro con a RNA monofilamento a polarità positiva 50-30 della famiglia dei Coronaviridae. Questi virus sono particelle di circa 125 nm e contengono un genoma virale di circa 30 coppie kb. I virioni hanno una glicoproteina spike strutturale, una proteina della membrana M (una glicoproteina transmembrana di tipo III), una proteina del nucleocapside (che è presente all’interno del doppio strato fosfolipidico). L’infezione da SARS-CoV inizia con il legame che si crea tra virus ed enzima di conversione dell’angiotensina2 (ACE2). ACE2 è largamente espresso nell’uomo, comprese le cellule epiteliali alveolari del polmone, le cellule epiteliali dell’intestino tenue, del sistema cardiovascolare, del sistema nervoso centrale e del rene. Questi target svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia del COVID-19. Il legame ACE2 e il successivo ingresso di CoV nelle cellule ospiti è mediato dalla glicoproteina spike che è composta da due subunità funzionali, S1 e S2. La subunità S1 è costituita da un dominio N-terminale e da un dominio di legame del recettore e agisce per legarsi al recettore della cellula ospite. La subunità S2 successivamente unisce il virus con le membrane cellulari. La proteina spike viene principalmente scissa da Furin, presente sulla membrana della superficie della cellula ospite, nei componenti S1 e S2 corrispondenti allo stato di prefusione.

Si pensa che la successiva fusione comporti una seconda scissione da parte di una proteasi di serina o di proteasi della cisteina endosomale, attivando la dissociazione di S1 e il piegamento irreversibile di S2 in una conformazione allo stato di fusione. Questi importanti riordinamenti strutturali sono necessari per la fusione delle cellule e della membrana e per il rilascio di RNA virale nel citoplasma. Pertanto, la glicoproteina spike è essenziale per l’ingresso di SARS-CoV-2 e rappresenta un eccellente target per lo sviluppo terapeutico dell’antivirale.

Le cellule presenti nei fluidi biologici, importanti per la comunicazione tra le cellule attraverso il rilascio di fattori bioattivi (proteine, lipidi e materiale genetico) sono coinvolte in processi fisiologici e patologici. È già noto che EV e virus hanno aspetti in comune: la loro biogenesi, l’assorbimento e la capacità di trasportare un carico specifico pur essendo entità diverse. Recenti scoperte dimostrano che i virus sfruttano le EV per il rilascio delle cellule e le EV controllano i meccanismi di ingresso del virus per la consegna del carico. I virus utilizzano le vie endocitiche delle EV per entrare nelle cellule non infette e modificano la via secretoria delle EV per uscire dalle cellule infette, spiegando così che le EV e i virus condividono meccanismi comuni di ingresso delle cellule e biogenesi. Inoltre, gli esosomi delle cellule infette contengono componenti virali, che sono importanti mediatori delle risposte antivirali, rendendoli ideali per un nuovo vaccino, nonché veicoli che facilitano la diffusione dell’infezione virale.

Dall’altro lato, l’ingegneria delle EV potrebbe essere interessante da un punto di vista antivirale. Uno studio recente ha dimostrato che le EV modificati con ACE2 limitano l’infezione da SARS-CoV-2.

Un altro studio ha mostrato la possibilità di utilizzare EV modificate con il dominio di legame-recettore della proteina spike virale che riconosce il recettore ACE2 come vettore target in vivo di potenziali agenti antivirali. Recentemente, Troyer Z et al. hanno dimostrato che le EV contenenti la spike SARS-CoV-2 interagiscono con il sistema immunitario umorale e riducono il siero che neutralizza gli anticorpi dei pazienti convalescenti .

Pertanto, questo studio mirava a generare un modello semplice, sicuro e scalabile per studiare approcci terapeutici per bloccare il legame e l’ingresso delle cellule SARS-CoV-2 utilizzando le proprietà delle EV. In particolare, abbiamo generato EV che presentano la proteina spike di SARS-CoV-2, essenziale per la fusione cellula-virus e l’ingresso nella cellula ospite in seguito al legame del recettore ACE2.

Per ottenere queste EV modificate, si è partito da cellule transfettate con il vettore spike, un metodo di ingegneria indiretta. è stata analizzata l’interazione spike-vescicole extracellulari (S-EV)-cellule endoteliali e abbiamo valutato l’effetto dell’anticorpo bloccante anti-ACE2 e della colchicina, un farmaco in fase di sperimentazione clinica per il trattamento del COVID-19.

Conclusioni

Lo sviluppo di vaccini, terapie e sistemi di somministrazione di farmaci sicuri ed efficaci al sito target è un settore su cui si è sempre più focalizzata l’attenzione al fine di superare il SARS-CoV-2 Questo lavoro dimostra il possibile utilizzo delle S-EV come metodo sicuro per lo studio del COVID-19 e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Fonte:

Generation of Spike-Extracellular Vesicles (S-EVs) as a Tool to Mimic SARS-CoV-2 Interaction with Host Cells – Roberta Verta, Cristina Grange, Renata Skovronova, Adele Tanzi, Licia Peruzzi, Maria Chiara Deregibus, Giovanni Camussi and Benedetta Bussolati