Con il termine HOS – High Order Structure – si intende l’insieme delle strutture secondaria, terziaria e quaternaria che, sinergicamente, conferiscono la conformazione tridimensionale di una macromolecola fondamentale per la sua stabilità e attività funzionale.

Struttura e funzionalità delle proteine sono inoltre fortemente influenzate dall’ambiente circostante. Infatti, a differenza delle piccole molecole chimiche, i prodotti biologici devono assumere uno stato conformazionale ben preciso, sebbene dinamico allo stesso tempo, per poter essere attive. Questo stato conformazionale è mantenuto da un delicato equilibrio di fattori, intrinseci o estrinseci alla molecola stessa, come la concentrazione della proteina stessa, tipologia e concentrazione di co-soluti, il pH della soluzione o anche variabili del bioprocesso spesso non facilmente monitorabili e/o controllabili.

Come dice il termine stesso High Order Structure, l’insieme delle singole caratteristiche si “combinano” sinergicamente per dare origine ad un ordine superiore, difficilmente riconducibile ai singoli tasselli, ma fondamentale per la funzionalità della molecola rappresentando così una proprietà dall’elevatissimo contenuto informativo e globalmente rappresentativa di un infinito numero di singole variabili tutte vocate all’unico obiettivo di rendere la molecola attiva a funzionale.

Con l’aumento dell’interesse verso i biofarmaci, per il ruolo che i prodotti biologici giocano nella ricerca di nuove terapie, l’aumentata complessità di alcuni di questi prodotti (ad es. coniugati farmaco-anticorpo o anticorpi bispecifici) e la estrema variabilità e complessità dei processi produttivi, la caratterizzazione dell’HOS ha acquisito un’importanza vitale per assicurarsi la loro stabilità, attività e non per ultima, la loro sicurezza, giocando un ruolo chiave anche nell’ambito dei prodotti biosimilari.

Recentemente, è stato istituito l’HOS Consortium con lo scopo di definire l’importanza di questa caratterizzazione cercando di individuare tecniche e metodologie adatte per una ottimale ed efficace integrazione all’interno di una strategia di sviluppo dei prodotti biologici.

Ovviamente, le tecniche analitiche svolgono un ruolo centrale e il consorzio ha valutato le diverse soluzioni presenti sul mercato attribuendo un punteggio in funzione della loro utilità rispetto alle diverse esigenze applicative (Fig. 1).

Figura 1. Classificazione quantitativa dell’utilità media di una selezione di tecniche di caratterizzazione HOS per varie attività di sviluppo biofarmaceutico, utilizzando la scala di grigi, da non utile (0, nero) a estremamente utile (3, bianco). Il diagramma è annotato con numeri che indicano l’utilità massima (2.2; DSC per lo sviluppo formulativo) e l’utilità minima (0.4; NMR, per lo sviluppo del processo). EoS, delucidazione della struttura; Pdc, caratterizzazione del prodotto; FFF, frazionamento del flusso di campo; AUC, ultracentrifugazione analitica; SEC – MALS, cromatografia ad esclusione dimensionale con diffusione della luce multi-angolo in linea; DLS, diffusione dinamica della luce; NMR, risonanza magnetica nucleare; HDX, scambio idrogeno-deuterio; DSC, calorimetria a scansione differenziale; IF, fluorescenza intrinseca; CD, dicroismo circolare. Gabrielson and Weiss IV, JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 104:1240–1245, 2015

È evidente come la microcalorimetria DSC risulti la tecnica più trasversale ed ortogonale con punteggi molto alti lungo tutta la pipeline. Questo riflette l’universalità della tecnica che ne ha fatto il “gold standard” nell’ambito dello studio della stabilità conformazionale. A differenza infatti di altre tecniche, che sono di natura fenomenologica (ovvero basati sull’osservazione di un effetto secondario), la microcalorimetria DSC è label-free e senza componenti ottiche, consentendo la lettura di un parametro intrinseco, direttamente legato al processo di danaturazione termica risultando meno propensa agli interferenti come co-soluti o matrici complesse.

Da una singola analisi DSC è possibile ottenere descrittori multipli del processo di transizione termica tra cui temperature ed energetiche di denaturazione e transizione (Tm , DH, DHvH, DCp, Tonset – inizio dell’unfolding – DT1/2), omogeneità della popolazione, risoluzione dei diversi domini, caratterizzazione dell’oligomerizzazione e della propensione all’aggregazione, percentuale di reversibilità delle transizioni e cinetiche dei processi.
Combinati insieme, tutti questi descrittori consentono di accedere a diversi livelli informativi in grado di rispondere a svariate esigenze.

Figura 2. Aumentata efficienza del processo di selezione del buffer di formulazione tramite screening primario della Tm e successiva ulteriore selezione tramite T1/2. Il disegno sperimentale illustrato può ovviamente essere applicato a qualsiasi variabile oggetto di confronto come ad esempio differenti condizioni di espressione, differenti costrutti etc.

Grazie alla microcalorimetria DSC è quindi possibile caratterizzare biomolecole fin dall’inizio del loro sviluppo consentendo di:

• Identificare i costrutti proteici candidati con potenziali problemi di stabilità a lungo termine
• Ottimizzare le condizioni di espressione, la purificazione e il processo di produzione
• Determinare le condizioni ottimali per formulazioni liquide.
• Valutare l’equivalenza conformazionale e la bio-similarità di biomolecole provenienti da diversi processi e fonti

Il MicroCal PEAQ-DSC di Malvern Panalytical è un sistema DSC ad altissima sensibilità e prestazioni, disponibile in una versione manuale o totalmente automatizzata, in grado di analizzare campioni a partire da una concentrazione di soli 10 µg/mL rendendo accessibile la misura anche in quei settori applicativi dove la disponibilità del campione è limitata. Inoltre, la possibilità di eseguire scansioni fino a 240 °C/hr, i sistemi di pulizia e verifica della baseline automatici forniscono la massima flessibilità e operabilità anche in contesti di HT screening. Il potente software di analisi consente di eseguire elaborazioni statisticamente significative ed oggettive garantendo confidenza, qualità ed integrità del dato.

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• Differential scanning calorimetry: Robust and powerful physical characterization of therapeutic protein products Clicca qui
• Value of DSC in characterization and optimization of protein stability as compared to other thermal stability assays Clicca qui