Lo studio delle cinetiche enzimatiche è una delle principali procedure analitiche in biochimica e la loro caratterizzazione è sempre più importante considerando il crescente interesse verso l’impiego di reazioni biochimiche in matrici fisiologiche così come l’impiego degli enzimi in diversi processi industriali.
Tradizionalmente, l’attività enzimatica, ovvero la capacità degli enzimi di catalizzare reazioni chimiche, viene determinata tramite svariate tecniche tra cui metodi spettroscopici, potenziometrici e cromatografici. Tutti questi metodi hanno però lo svantaggio di essere limitati a particolari condizioni analitiche e di non essere adatti allo studio delle cinetiche enzimatiche in matrici complesse, torbide o in campioni molto concentrati, richiedendo spesso forti diluizioni portando così ad allontanarsi dalle condizioni reali; basti pensare che nel citosol la concentrazione di proteine può raggiungere i 400 mg/mL e queste condizioni possono impattare notevolmente sulle cinetiche enzimatiche a causa dell’ingombro sterico generato. Inoltre spesso è richiesta la presenza di un cromoforo intrinseco o di una opportuna marcatura.
La microcalorimetria ITC trova larga applicazione in questo contesto; essendo infatti totalmente indipendente dalle proprietà ottiche delle soluzioni, consente di studiare le cinetiche enzimatiche in matrici complesse e ad alte concentrazioni proteiche permettendo una caratterizzazione dei sistemi in condizioni reali fornendo informazioni quantitative in condizioni fisiologiche o di processo biotecnologico rilevanti. La microcalorimetria ITC si basa sul principio generale della misura del flusso di calore (rilasciato o assorbito) di una reazione chimica. Nel caso della reazioni catalizzate da enzimi il flusso di calore è in relazione diretta con il tasso di formazione del prodotto.
Per studiare i processi di catalisi enzimatica tramite ITC è richiesta la misura di due differenti parametri: l’entalpia molare totale della reazione (ΔHreact) e il flusso di calore nel tempo (dQ/dt).
I sistemi MicroCal PEAQ-ITC di Malvern Panalytical consentono, tramite un semplice esperimento a singola iniezione o ad iniezioni multiple, di ottenere questi valori per poter ricavare tutti i parametri cinetici di Michaelis-Menten (KM, kcat e vmax) così come le variabili termodinamiche che governano il processo.
Gli esperimenti a singola iniezione consentono di misurare simultaneamente ΔH e dQ/dt grazie all’iniezione continua di substrato in una soluzione di enzima. Questa operazione avvia la reazione enzimatica che raggiunge immediatamente la sua massima velocità (vmax). Questa situazione è realizzabile solo quando la concentrazione iniziale di substrato supera di molto la KM dell’enzima e comporta un iniziale stato stazionario del segnale calorimetrico (DP). In seguito, si inizia ad osservare il decadimento del segnale che torna verso la linea di base. Questo approccio consente di ottenere risultati molto rapidamente e senza particolari ottimizzazioni; risulta molto facile anche lo studio di processi di inibizione (Figg. 1 e 2).
Figura 1 Analisi in singola iniezione dell’idrolisi di BAEE con tripsina. In alto i dati grezzi e in baso i dati elaborati con relativo moldello di fitting. L’analisi, di soli 16 minuti è stata eseguita con un sistema MicroCal PEAQ-ITC.
Figura 2 Analisi in singola iniezione dell’idrolisi di BAEE con tripsina in presenza di inibitore. Nero: esperimento di controllo, con 4 mM BAEE nella siringa ITC e tampone nella cella ITC; rosso: 4 mM BAEE nella siringa ITC e 20 nM Trypsina nella cella ITC (senza inibitore): verde: BAEE 4 mM nella siringa ITC e tripsina 20 nM + benzamidina 95 μM (inibitore) in ITC cella, volume di iniezione di 5 μl. [Dati di Malvern Panalytical]
Se la cinetica enzimatica oggetto dello studio non consente di ottenere una conversione completa del substrato in prodotto durante il tempo dell’esperimento o se la KM è troppo alta per consentire il raggiungimento della vmax in una singola iniezione, questo disegno sperimentale consentirà di derivare “solamente” l’entalpia di reazione che verrà impiegato per l’analisi combinata con l’altra variante sperimentale a iniezioni multiple.
L’approccio sperimentale a iniezioni multiple consiste nello aggiungere aliquote discrete di substrato con una velocità tale che una piccola quantità si accumuli nella cella di reazione ad ogni aggiunta comportando un aumento del tasso di conversione con conseguente dislocamento del segnale di equilibrio termodinamico (linea di base iniziale, DP) fino al raggiungimento della velocità massima. Idealmente, in questa condizione sperimentale solo il 5% del substrato viene convertito generando una condizione di stato stazionario a ciascuna concentrazione di substrato (Fig. 3).
Figura 3 (In alto) Segnale calorimetrico grezzo per esperimento di cinetica enzimatica a iniezioni multiple per l’idrolisi di 4MU-α-GlcNS da parte di un enzima lisosomiale. (In basso) Rate vs concentrazione di substrato.
Una volta che i parametri cinetici sono stati determinati è possibile ripetere l’esperimento includendo inibitori a diverse concentrazioni, variando la temperatura sperimentale (gli strumenti MicroCal PEAQ-ITC consentono di esplorare il range 2-80 °C) o le condizioni di reazione.
Per approfondire vi invitiamo scaricare le note applicative Malvern Panalytical dedicate a questa applicazione:
1. The Use Of Itc For Obtaining Enzyme Kinetic Constants: clicca qui
2. Using Isothermal Titration Calorimetry To Characterize Enzyme Kinetics Part 1: Principles clicca qui
3. Enzyme Kinetics Assays With Microcal Itc Systems Part 2: Methods clicca qui
