Lo studio di sistemi complessi spesso richiede l’uso di diverse tecniche ortogonali e complementari per una sua descrizione completa ed accurata.
Lo studio del “comportamento” di nanomateriali e nanostrutture, in termini di assemblaggio, attività ed interazione con altri sistemi (biologici e non) è spesso articolato, frammentario e poco preciso.
I nanomateriali giocano un ruolo sempre più importante e, in alcuni casi, fondamentale nello sviluppo di nuove tecnologie di drug delivery, diagnosi e terapeutiche. Se ben progettati, i nanomateriali trovano impiego in diversi ambiti della nanomedicina:
- Piattaforme di drug delivery
– Targeting e delivery specifico
– Minimizza il rischio per le cellule sane
– Minore tossicità e maggiore efficacia terapeutica
– Maggiore sicurezza - Terapie geniche
– Quantum dots – nanocristalli semiconduttivi
– Applicazioni diagnostiche – impiegati per identificare e localizzare diversi tipi di cellule e attività biologiche - Trattamenti termici
– Nanomateriali che se opportunamente eccitati bruciano le cellule target
Figura 1 Classi di nanoparticelle con rispettivi materiali e applicazioni (De Jong and Borg, Int. J. Nanomedicine, 3, 133-149, 2008)
I nanomateriali quindi, se opportunamente progettati, possono essere estremamente versatili e trovare applicazioni in svariati settori. Sono numerosi i vantaggi che si possono ottenere ottimizzando diverse proprietà come il drug-loading, il controllo del rilascio e il targeting; ciò si ottiene aggiungendo funzionalità alle nanoparticelle (Fig. 2) progettando così il comportamento richiesto. Questo è possibile grazie all’aggiunta/modifica di funzionalità superficiali come la ciclodestrina per aumentare l’equisolubilità del farmaco e ligandi per riconoscere la struttura molecolare specifica.
Figura 2 From Bouchemal, Drug Discov. Today, 13, 960-972, 2008
Conoscere come avviene il processo di assemblamento della nanostruttura e la sua successiva attività è estremamente importante nell’ottimizzazione del processo di design e nella caratterizzazione della struttura finale.
La microcalorimetria ITC è una tecnica universale, in soluzione e label-free, che permette di studiare il legame, o l’adsorbimento, di qualsiasi (bio)molecola sulla superficie di un nanomateriale così come la caratterizzazione dell’affinità tra la nanoparticelle opportunamente ingegnerizzata e il suo target biologico. Da un punto di vista applicativo maggiormente “chimico-fisico”, un esperimento ITC può anche abilitare lo studio dell’assemblamento dello stesso nanomateriale.
Un esperimento ITC è concettualmente molto semplice e i nuovi traguardi tecnologici rendono ancora più semplice l’accesso a risultati robusti e di qualità. Un sistema ITC è costituto da due celle (analisi e riferimento) e da un sistema di titolazione automatico (Fig. 3). I due partner dell’interazione sono caricati rispettivamente in cella d’analisi (analita) e nella siringa di titolazione (ligando). Il sistema ITC esegue una serie di aggiunte discrete e costanti del ligando nella cella d’analisi andato a registrare il calore rilasciato o assorbito dal processo termodinamico di interazione tra i due analiti (Fig. 4). Il segnale registrato per ciascuna iniezione viene integrato e l’area, ovvero il calore generato da quello specifico processo, viene plottata contro la concentrazione relativa. Il grafico ottenuto viene quindi analizzato da opportuni modelli per ricavare costante di affinità (KD), stechiometria (n) ed entalpia (ΔH); in questo modo è possibile ricavare direttamente tutti i parametri descrittori dell’interazione e del meccanismo d’azione (Fig. 5).
Figura 3 Rappresentazione schematica di un sistema ITC
Figura 4 Rappresentazione di un flusso sperimentale
Figura 5 Risultato finale di un esperimento ITC
In letteratura sono numerosi gli esempi dell’applicazione della microcalorimetria ITC nello studio dei nanomateriali.
Seker et al. (Seker, et al, Nano Lett. 11, 1530-1539, 2011) descrivono un approccio per la costruzione di conduttori colloidali nanocompositi (QDot) utilizzando peptidi polielettroliti per il controllo del trasferimento energetico non radioattivo. La microcalorimetria ITC è stata utilizzata per caratterizzare la termodinamica delle interazioni polipeptidiche in funzione dell’alterazione delle lunghezze della catena come valutazione della formazione e dell’assemblaggio dei Qdot.
Figura 6 Termogrammi di diverse coppie di peptidi e diverse lunghezze e risultati analitici.
Jensen et al. (Jensen, et al, Int. J. Pharmaceutics 416, 410– 418, 2011) hanno descritto il meccanismo molecolare di assemblamento dei dendrimeri PAMAM–siRNA e l’effetto della densità di carica. I dendrimeri sono di interesse nell’ambito per del delivery delle terapie geniche grazie al loro alto livello di monodispersione e facilità di design. La microcalorimetria ITC ha abilitato lo studio del processo di autoassemblaggio tra piccoli siRNA e diverse generazioni di dendrimeri di poli (amidoamina).
Figura 7 Titolazioni ITC di siRNA con diverse generazioni di dendrimeri. Le diverse configurazioni di dendrimeri mostrano evidenti differenze nel binding legate alla diversa rigidità e dimensione. Tutti e tre i sistemi studiati seguono un processo primario di natura esotermica; b e c mostrano anche contributi bifasici di natura endotermica.
Numerosi sono anche gli studi di adsorbimento ed attività come lo studio dell’effetto protein-corona (Cedervall, et al, PNAS, 104, 2050–2055, 2007), l’adsorbimento di RNAse A su silice mesoporosa e il conseguente effetto sull’attività catalitica (Matlahov, et al, Phys.Chem.Chem.Phys., 16, 9031-9038, 2014) o, ancora, l’incapsulazione di TMP in nanoparticelle di chitosano/alginato funzionalizzate con un anticorpi (Abdelghany, et al, Biomacromolecules 14, 302−310, 2013).
Figura 8 Studio dell’effetto protein-corona. Titolazione ITC di HSA in soluzioni di nanoparticelle da 70 nm con diversi rapporti NIPAM / BAM 50:50 (Sinistra) e 85:15 (Destra). Esperimenti a 5 ° C. (In alto) Dati grezzi. (In basso) Calore integrato per ogni iniezione rispetto al rapporto molare tra proteina e nanoparticelle; fitting utilizzando un modello di legame in un sito. (Inset) Confronto dimensionale di albumina e particelle di diametro 70 o 200 nm. [Cedervall, et al, PNAS, 104, 2050–2055, 2007]
Figura 9 Dati ITC dell’interazione di adsorbimento tra 0,40 mM RNasi A e 0,476 mg/ml di MCM41 (Silice mesoporosa in sospensione); fitting della curva con modello a singolo sito. [Matlahov, et al, Phys.Chem.Chem.Phys., 16, 9031-9038, 2014
Figura 10 Titolazione ITC di TMP (1 mM) in soluzione di alginato (15 mM). Le titolazioni sono state eseguite in acqua deionizzata a 25 ◦C. Affinità di legame ~ 10-5 M-1 Una variazione di entalpia negativa (ΔH) e una variazione di entropia positiva (ΔS) sono indicative di un’interazione elettrostatica tra farmaco e polimero. [Abdelghany, et al, Biomacromolecules 14, 302−310, 2013]
L’universalità della tecnica ITC consente lo studio dei sistemi più vari grazie al principio assoluto sulla quale si basa: ogni reazione infatti rilascia o assorbe calore. Non avendo limiti di peso molecolare, non richiedendo la marcatura/cattura degli analiti e senza l’interferenza data dalle proprietà ottiche dei materiali, rappresenta una tecnica veramente versatile e di riferimento per lo studio di qualsiasi processo interattivo.
