A volte nel fare ricerca ci si scontra con dei limiti invalicabili, imposti dalle leggi della fisica, che limitano la nostra capacità di fare esperimenti e di progredire nella conoscenza. Nell’ambito della microscopia, una di queste barriere infrangibili è il limite di diffrazione della luce.
Questa legge fisica stabilisce che la nostra capacità di risolvere due punti (ovvero di visualizzarli come chiaramente separati) viene meno quando questi siano più vicini circa della metà della lunghezza d’onda utilizzata per osservarli. Questo all’atto pratico significa che i microscopi ottici e a fluorescenza potrebbero risolvere solo oggetti e strutture separata da più di 200 nm, non essendo quindi strumenti validi per lo studio di strutture cellulari e organelli più piccoli di questa misura.
Tuttavia, nel primo decennio del XXI secolo, il limite di diffrazione della luce è stato abbattuto grazie ad una serie di ingegnose tecniche di microscopia. Sono infatti diventati disponibili per i riceratori metodi cosìddetti di “super-risoluzione” come STED (stimulated emission depletion microscopy), STORM/PALM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy/Photo-Activated Localisation Microscopy) e SIM (Structured Illumination Microscopy).
Nonostante gli enormi passi avanti permessi dalle tecniche di super-risoluzione, ci sono alcuni aspetti che ne limitano l’applicabilità: la complessa preparazione dei campioni, le lunghe tempistiche di acquisizione e il bisogno di utilizzare laser ad alta potenza rendono questi metodi inadeguati (se non addirittura in alcuni casi incompatibili) per l’uso con campioni a cellule vive. Inoltre, i requisiti tecnologici ed hardware li rendono costosi e relativamente inaccessibili per molti laboratori.
Un’opzione rimane sempre quella di ricorrere alla riassegnazione computazionale dei fotoni (photon reassignment), una forma di deconvoluzione che permette un miglioramento di un fattore ~1.5 della risoluzione laterale e fino ad un fattore 2 di quella assiale. BC43 offre da sempre, a questo fine, l’algoritmo di photon reassignment Clearview™ integrato nel software di acquisizione il quale permette di ottenere immagini nitide e brillanti, ad alta risoluzione ed elevato Signal-to-Noise Ratio, mediante una rapida elaborazione post-acquisizione.
Finora però, le necessità di una super-risoluzione più spinta potevano essere soddisfatte solo con strumenti o hardware dedicato. Ma oggi c’è una nuova risposta a queste necessità: l’integrazione di SRRF-Stream+ in BC43-SR (Figura 1).
Figura 1 – Confronto tra imaging confocale, imaging confocale con deconvoluzione e imaging confocale con SRRF-stream+. Sono presenti primi piani ad alto ingrandimento per una migliore visualizzazione della risoluzione ottenuta. Cellule BPA colorate con falloidina, mitotracker e DAP immagine con Ixon 888 in modalità confocale (senza SRRF) e modalità confocale con SRRF-stream+.
Nel 2016, l’Henriques lab a Lisbona ha sviluppato un approccio alternativo alla super-risoluzione chiamato SRRF – Super-Resolution Radial Fluctuations (Gustafsson et al., Nat. Commun 2016). SRRF è un algoritmo che può essere combinato sia con la modalità widefield-epifluorescenza che con la modalità confocale e che, dipendentemente dalle proprietà del dataset acquisito, permette di raggiungere risoluzioni in XY fino a 50nm.
Inoltre, SRRF è totalmente compatibile con fluorofori e proteine fluorescenti convenzionali, non richiedendo quindi una preparativa particolare per i propri campioni.
Per ottenere un’immagine SRRF sarà sufficiente acquisire tra i 20 e i 100 frames in rapida sequenza (maggiore il numero di frames, migliore la risoluzione – Figura 2) e far lavorare l’algoritmo; il tutto mantenendo basso l’irraggiamento e quindi mantenendo la piena compatibilità con condizioni di cellule vive.
Figura 2 – Workflow dell’algoritmo SRRF. Il primo step consiste nella suddivisione di ciascun pixel in un set di “subpixels”. Attorno a ciascuno di questi subpixel viene generato un anello, che viene utilizzato per il calcolo dei gradienti di simmetria radiale. I pixel dove si localizza il segnale avranno un alto livello di convergenza (trovandosi vicino o al centro della PSF), mentre i pixel del background lo avranno molto basso (poiché il background tende a mancare di simmetrie radiali). Questa analisi spaziale viene ripetuta per ciascun frame del dataset e viene quindi eseguita un’analisi temporale, che permette di eliminare segnali che non siano temporalmente correlati (e.g. picchi di radialità dovuti a segnali temporanei, oppure rumore di fondo). Dall’incrocio delle due analisi – spaziale e temporale – è finalmente possibile generare un’immagine SRRF. Immagine da (Culley et al. 2018b).
SRRF-Stream è l’implementazione di Andor dell’algoritmo SRRF, nata nel 2018 da una collaborazione tra Andor e l’Henriques Lab, che fornisce immagini a super-risoluzione al volo con un semplice clic e che nel 2020 viene ulteriormente migliorato dando vita all’algoritmo SRRF-Stream+.
Come nel caso dell’algoritmo SRRF originale, la risoluzione di SRRF-Stream+ migliora con il numero di fotogrammi acquisiti, ma vi sono anche molti altri fattori che influiscono sulla risoluzione finale, tra cui parametri specifici di SRRF come la Radiality Magnification (i.e. quanti subpixels vengono generati) ed il Ring Radius (i.e. la dimensione dell’anello utilizzato per il calcolo dei vettori di intensità del gradiente), che andrebbero di volta in volta testati e ottimizzati.
In BC43-SR, questi parametri sono preimpostati per diversi tipi di campione (spessi o sottili) e disponibili con vari livelli di stringenza.
In sostanza, con la modalità SRRF BC43 mette a disposizione dei ricercatori una tecnica di super-risoluzione semplice e rapida, adatta alla maggior parte delle applicazioni.
Queste vanno dalla morfologia degli organelli, ai processi riguardanti il citoscheletro, passando per il traffico vescicolare e gli studi di uptake cellulare.
La modalità a super-risoluzione può essere combinata con tutti i protocolli presenti nel software di acquisizione Fusion, permettendo l’acquisizione di immagini estremamente nitide su ampi FOV, in profondità all’interno di cellule o tessuti, e anche in time-lapse (Video 1 e 2).
L’elaborazione delle immagini a super-risoluzione viene infatti eseguita fino a 30 volte più velocemente rispetto all’algoritmo SRRF originale presente in ImageJ (“NanoJ-SRRF”) e in parallelo con l’acquisizione dei tati, con una resa praticamente in tempo reale.
Video 1: Immagine widefield di una cellula HeLa esprimente tubilina-GFP. L’immagine statica è seguita da un time-lapse della stessa regione acquisitor in modalità SRRF-Stream+. Campione cortesia di David Albrecht (Ricardo Henriques e Jason Mercer labs, UCL).
Video 2: Confronto tra immagini time-lapse acquisite in modalità TIRF e SRRF-Stream+ di cellule Jurkat T esprimenti LifeAct-GFP e fatte crescere su coverslips con rivestimento di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 per stimolare la formazione di sinapsi immunologiche. Cortesia di Ricardo Henriques (MRC-LMCB, University College London).
In conclusione, SRRF offre una modalità a super-risoluzione compatibile con le cellule vive e in grado immagini super-risolte di strutture intracellulari senza artefatti. Oxford Instruments Andor mette a disposizione questa tecnologia sui microscopi della linea BC43 e sulle piattaforme della linea Dragonfly.
