Durante lo sviluppo di farmaci bioterapeutici è richiesta la caratterizzazione di un ampio range di proprietà biofisiche per supportare il processo decisionale e fornire un pannello di evidenze robuste agli enti regolatori. Questi ultimi, in conseguenza alla crescita esponenziale della diffusione dei farmaci biologici, hanno rivisto i requisiti per tecniche e metodologie analitiche in grado di fornire dati statisticamente validati anche su sistemi così complessi.
Molecole così complesse, soprattutto se comparate alle “tradizionali” molecole chimiche, presentano sfide tecnologiche e analitiche significative con attributi di qualità come la High Order Structure (HOS) che si potrebbe definire come l’effetto sinergico della struttura secondaria, terziaria e quaternaria, responsabile della corretta conformazione della macromolecola.
HOS è normalmente caratterizzata grazie ad una varietà di tecniche analitiche biofisiche, tra cui Dicroismo Circolare, SEC-MALS, Calorimetri a Scansione Differenziale (DSC), DLS, FTIR etc.
La caratterizzazione oggettiva, quantitativa e statisticamente validata di questa e altre simili proprietà è tutt’ora una sfida. Grazie all’analisi CD ad alta sensibilità dei sistemi Chirascan V100 e Chiarascan Q100 di Applied Photophysics è possibile ricavare dati di elevata qualità da poter sottoporre ad una rigorosa analisi statistica in grado di individuare differenze anche minime nella struttura secondaria e terziaria delle proteine per determinare oggettivamente effetti e contributi di diversi parametri così come supportare studi di biosimilarità.
Studi di biosimilarità
Confronto tra 3 lotti di biosimilare e 3 lotti di innovatore. I dati sono stati confrontati utilizzando il metodo della differenza spettrale ponderata (WSD) per generare un attributo di qualità per l’analisi statistica. Questo attributo è stato analizzato con un approccio basato su un intervallo di qualità con criteri di accettazione +/-2SD.
Analisi della struttura secondaria in far-UV
Le differenze riscontrate non sono significative.
Analisi della struttura teriziaria in near-UV
In questo caso le differenze riscontrate sono significative.
Studi di degradazione
Un campione di IgG1 è stato sottoposto a diverse condizioni degradative. I campioni così stressati sono stati analizzati rispetto ad un’aliquota non trattata tramite il sistema Chirascan Q100. Si riportano di seguito gli spettri ottenuti nella regione near-UV.
L’analisi statistica, resa possibile dall’acquisizione di dati di elevata qualità e risoluzione, evidenzia la significatività delle differenze secondo un approccio basato su un intervallo di qualità con criteri di accettazione +/-2SD.
In un secondo studio è stato caratterizzato l’effetto dell’esposizione a nanoparticelle di ossido di Alluminio di due enzimi globulari.
L’enzima 2 risulta alterato per quanto riguarda la sua struttura secondaria. L’alterazione è confermata da studi di stabilità termica che mostra un andamento del processo di denaturazione distorto rispetto al campione non trattato.
Studi quantitativi strutturali
L’analisi ad alta risoluzione consente di andare oltre l’utilizzo tradizionale del dicroismo circolare.
Durante le prime fasi di sviluppo è importante poter discriminare variabili di processo in grado di causare anche solo minime differenze strutturali. In questo studio è stato dimostrato come sia possibile rilevare la presenza di anche piccolissime quantità di un anticorpo monoclonale in una soluzione di un anticorpo monoclonale altamente similare definendone limiti di rilevabilità e quantifica.
L’accesso a queste informazioni è possibile grazie alla combinazione di diversi accorgimenti tecnologici allo stato dell’arte che, in sinergia, consentono di ottenere dati di elevata qualità, riproducibilità e risoluzione. I sistemi Chirascan V100 e Q100 combinano un detector APD, soluzione unica sul mercato, per una lettura simultanea di segnale CD ad altissima sensibilità e segnale UV, con la tecnologia di calibrazione hardware multi-lunghezza d’onda per una precisa normalizzazione del segnale. Il preciso controllo della temperatura in-sample e la possibilità di fare esperimenti di denaturazione termica multi-lunghezza d’onda analizzabili tramite il software integrato di analisi termica globale completano la dotazione hardware e software di questi sistemi CD ad altissime prestazioni. Infine, la possibilità di interfacciare un autocampionatore consente infine di abbattere ulteriormente la potenziale variabilità eliminando la soggettività dell’operatività manuale.
