Piattaforma per la misura della stabilità delle proteine: guida all’acquisto

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Piattaforma per la misura della stabilità delle proteine: guida all’acquisto

Tecnologie di analisi della stabilità delle proteine per l’industria biofarmaceutica

Abstract

La stabilità delle proteine e della loro struttura complessa (High order structure) rimane un aspetto fondamentale degli studi di biocomparabilità. Questa guida all’acquisto descrive la strumentazione disponibile per la caratterizzazione della stabilità delle proteine e le variabili da tenere in considerazione nella scelta dei test di stabilità.

Overview
La maggior parte dei prodotti bio-terapeutici sono costituiti da proteine o derivati, ed attualmente la principale classe di biofarmaci sul mercato è costituita dagli anticorpi monoclonali (mAbs). Gli anticorpi, grazie alla loro specificità di legame, sono utilizzati dall’industria biofarmaceutica per modulare l’attività di molecole target, rilevanti dal punto di vista farmaceutico, al fine di controllare o prevenire malattie.  Le proteine però sono molecole notoriamente instabili; ed è dunque necessario sviluppare approcci formulativi che consentano di produrre le molecole bioterapeutiche e conservarle in soluzione per lunghi periodi senza che si degradino. Questa problematica rende i test di stabilità proteica cruciali nello sviluppo e la produzione dei biofarmaci.

I test di stabilità in tempo reale sono indispensabili per valutare la longevità o shelf-life di una proteina in soluzione. Tuttavia, essendo questi test spesso lunghi e tediosi, altri metodi predittivi e più veloci sono stati sviluppati così da accelerare lo sviluppo delle formulazioni biofarmaceutiche e l’ottimizzazione delle condizioni di processo. Tra i più comuni metodi predittivi troviamo i metodi basati sulla denaturazione termica dove si monitorano le proprietà fisiche delle proteine in funzione della temperatura determinando la melting temperature della molecola, da utilizzare in studi comparativi.

E’ generalmente riconosciuto che le molecole che richiedono temperature più alte per indurre modifiche della loro conformazione nativa si conservino più a lungo, ovvero presentino una maggiore stabilità. Misurando i profili di unfolding di diverse biomolecole terapeutiche nello stesso tampone è possibile paragonare la stabilità termica di potenziali farmaci. Quest’applicazione viene definite “Selezione di Candidati”. I profili di stabilità termica possono essere generati, in un range di tamponi in modo da identificare le migliori condizioni di stabilità o d’instabilità. Gli additivi o eccipienti tipicamente utilizzati sono amminoacidi, zuccheri, polioli, sali e detergenti ed è importante assicurarsi che queste sostanze non interferiscano con il test. Questi test vengono solitamente svolti dai gruppi di pre/formulazione e di sviluppo di processo. Quest’ultimi, ad esempio, mirano ad individuare le strategie di purificazione che massimizzino la resa, identificando il migliore tampone e eluente per i processi cromatografici e l’ottimizzazione degli step di inattivazione virale.

Figura 1: Termogrammi DSC ottenuti per la stessa proteina in buffer diversi. Lo studio ha permesso di determinare le migliori condizioni di eluizione in fase di purificazione.

 

Figura 2: Studio degli effetti delle condizioni di inattivazione virale hanno mostrato una apparente perdita della struttura del dominio Fc (Tm1 e Tm3).

  

Infine, l’estrema sensibilità delle tecniche analitiche più moderne, come la calorimetria a scansione differenziale (DSC), sono impiegate anche negli studi di biosimilarità e comparabilità consentendo studi di similarità oggettivi e validati statisticamente.

Figura 3 Studio di similarità svolto per l’approvazione di un biosimilare (Neopogen (innovator) vs Zarzio (biosimilar)). L’analisi statistica ha permesso di definire un “similarity score” accettato e approvato dalle agenzie di controllo.

  

Come già detto, si ipotizza che le molecole con temperature di denaturazione più alte siano più stabili. Tuttavia, questa regola generale, può essere fuorviante se la tecnica scelta per monitorare le trasformazioni non rileva alcuni cambiamenti di conformazione delle proteine o i processi di inattivazione chimica. Questa è solo una delle ragioni per cui è importante fare delle attente considerazioni prima di acquistare uno strumento di misura della stabilità delle proteine.
Esistono infatti sul mercato diverse tecnologie per la misura della stabilità. Molti produttori dimostrano però la qualità dei dati generati da queste tecnologie confrontandoli con i dati di microcalorimetria a scansione differenziata (DSC). La DSC risulta quindi essere il “gold standard” analitico e l’elevata stima della comunità scientifica per i dati generati da questa tecnica ne è la dimostrazione.
Si citano di seguito le parole di un utilizzatore DSC che mette in luce la forza della tecnica:

La DSC è il più potente, informativo e rilevante metodo biofisico tra quelli attualmente disponibili”  Sorina Morar-Mitrica, Ph.D – GlaxoSmithKline; The BioProcessing Summit,2012

Quali sono le domande chiave da porsi prima dell’acquisto di uno strumento per lo studio della stabilità delle proteine?
  • Voglio poter caratterizzare la stabilità di ogni dominio di una proteina?
  • Ho bisogno di dati semplice da analizzare?
  • Devo poter rilevare piccoli cambiamenti nella stabilità delle mie proteine?

Per scoprire come la microcalorimetria DSC risponda a queste e molte altre domande, scarica la nota applicativa allegata e/o contatta il nostro product manager, Andrea Pigozzo – andrea.pigozzo@alfatest.it

   

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