La calorimetria a scansione differenziale (DSC) è riconosciuta come il “gold-standard” delle tecniche di caratterizzazione biofisica e viene impiegata da decenni per studiare la stabilità termica di macromolecole in soluzione come proteine e DNA^[1]. Generalmente applicata su campioni purificati, di recente ha trovato spazio un’applicazione meno convenzionale ma molto promettente: l’analisi di campioni biologici complessi come siero, plasma, fluido cerebrospinale e molti altri fluidi biologici^[2-5]. Il profilo di denaturazione di questi fluidi biologici è dato dalla sinergia di tutte le componenti del campione stesso; l’insorgere di una patologia può portare ad una modifica nella composizione, in termini di concentrazione e presenza delle proteine costituenti il proteoma di questi fluidi che, a sua volta, può comportare un cambiamento significativo e riproducibile nel profilo calorimetrico generando un’impronta digitale della specifica patologia. Infatti, il termogramma DSC del plasma sanguigno di soggetti sani contrasta significativamente con quelli di pazienti con diverse patologie (da patologie infiammatorie a patologie oncologiche). Un numero sempre più crescente di pubblicazioni ha dimostrato la versatilità e le prestazioni dell’analisi DSC in ambito clinico su una serie di biofluidi e in uno svariato numero di casistiche e patologie portando a promettenti e notevoli vantaggi in ambito diagnostico e di monitoraggio terapeutico ^[2-10]. Taneva et al. hanno confermato questi studi preliminari e hanno riportato nuovi dati che rivelano diverse e considerevoli modificazioni indotte da mieloma in termogrammi di siero ^[11]. Alterazioni specifiche nella risposta termica del plasma sanguigno sono state anche individuate in pazienti affetti da cancro colorettale ^[12]. Tutti questi lavori hanno contribuito alla convalida della microcalorimetria DSC come potenziale strumento non invasivo per diagnosticare e discriminare diverse neoplasie così come lo stato terapeutico. Le ipotesi alla base dell’applicazione della DSC per la diagnosi clinica sono:

•  Il siero del sangue è composto principalmente da proteine e metaboliti;
•  l’alterazione metabolica associata a una determinata patologia può alterare la composizione del siero nel sangue in cui proteine e metaboliti possono subire cambiamenti di concentrazione;
• I metaboliti non possono essere sottoposti a transizioni conformazionali, ma possono interagire con le proteine che modulano la loro stabilità termica;
• Il termogramma acquisito tramite denaturazione termica è il risultato complessivo della denaturazione termica di un insieme di proteine in presenza di metaboliti, e quindi riflette la composizione proteica e metabolica del campione di siero ^[2-5].
• Le dieci proteine più abbondanti nel siero del sangue (albumina, IgG, fibrinogeno, aptoglobina  etc.) rappresentano il 90% (p/p) del siero. Altre dodici proteine rappresentano il prossimo 9% e 3000 proteine rappresentano l’1% finale. È interessante notare che il normale termogramma sierico può essere ragionevolmente riprodotto solo con le proteine più abbondanti. Pertanto, i termogrammi sierici non forniscono informazioni dirette sulle restanti proteine sieriche a bassa concentrazione. Tuttavia, la capacità di tali proteine, così come i metaboliti associati alla malattia, di legarsi e alterare le temperature di denaturazione delle proteine più abbondanti è responsabile delle variazioni osservate nei termogrammi degli stati patologici.

Patologie e disturbi innescano alterazioni nella composizione di proteine e metaboliti come up-down o down-regulation di specifiche proteine così come la presenza/assenza di metaboliti specificamente correlati alla malattia . La sinergia di tutte queste caratteristiche si rispecchia in termogrammi distorti rispetto a quelli di soggetti sani. Il termogramma DSC può essere considerato come un’immagine istantanea che riflette lo stato di salute di un dato individuo. A questo proposito, ci sono due punti chiave:

• sviluppare metodologie analitiche/statistiche appropriate per confrontare i termogrammi ed estrarre informazioni preziose sulle caratteristiche differenziali;
• correlare le caratteristiche differenziali tra i termogrammi con differenze fisiologiche tra gli individui.

Il primo problema può essere ragionevolmente affrontato utilizzando indici metrici globali (ad esempio, il coefficiente di correlazione di Pearson, la massima capacità termica, la temperatura per la massima capacità termica, i momenti termografici) per misurare la similarità tra i termogrammi[14], o attraverso analisi fenomenologiche multiparametriche in cui possono essere rilevate le caratteristiche differenziali. Tuttavia, il secondo è un compito difficile considerando che alcune delle differenze potrebbero derivare da eventi fisiologici attualmente sconosciuti. L’analisi del plasma sanguigno DSC  ha trovato applicazione su diversi tipi di pazienti oncologici e sono stati determinati diversi modelli di profilo. I pazienti in un determinato studio devono essere caratterizzati e classificati con precisione al fine di ridurre al minimo gli errori nella definizione dei parametri di differenziazione del profilo per una determinata malattia. Stabilire il gruppo di controllo costituito da individui sani presi come riferimento per qualsiasi malattia è un altro punto molto importante. La Figura 1 mostra l’omogeneità di un insieme arbitrario di soggetti sani rispetto al loro termogramma sierico.

Figura 1 Termogramma medio sierico per 25 soggetti sani (linea spessa). L’area grigia indica la deviazione standard per il segnale misurato (capacità termica).

L’analisi di sieri provenienti da pazienti con diverse patologie oncologiche ha riscontrato differenze significative tra le patologie stesse (Figura 2).

Figura 2 Termogrammi medi sierici per diverse patologie: epatocarcinoma (blu), adenocarcinoma gastrico (verde) e adenocarcinoma colorettale (rosso). Viene anche mostrato il termogramma medio sierico per individui sani (nero).

Per approfondimenti specifici invitiamo alla lettura di alcuni lavori focalizzati sull’adenocarcinoma gastrico (GAC). Il GAC è il quarto tumore più comune e la seconda causa più frequente di decessi per cancro in tutto il mondo ^[15]. Lo studio microcalorimetrico svolto da Vega et al.  ha permesso di impostare una metodologia analitica fenomenica e multiparametrica in grado di identificare e classificare pazienti in base alla gravità/stadio della malattia (Fig. 3 e 4) ^[16].

Figura 3 Termogrammi sperimentali da un soggetto sano (A) e da un paziente con adenocarcinoma gastrico stadio I (B). In alto le analisi di deconvoluzione.

Figura 4 Parametri globali e locali dai termogrammi del siero rispetto all’area totale del termogramm. I diversi gruppi di soggetti sono codificati per colore: soggetti sani (neri), pazienti GAC di stadio I (verdi), pazienti GAC di stadio II (arancione), pazienti GAC di stadio III (rossi).

La microcalorimetria DSC presenta importanti vantaggi. Innanzitutto, fornisce il profilo dello stato metabolico nel siero al momento preciso dell’estrazione del campione, senza concentrarsi su biomarcatori specifici. Questo è molto importante considerando che molte malattie sono attualmente prive di biomarcatori noti. Secondo, fornisce informazioni globali sullo stato di salute attuale, fornendo un quadro globale dello stato metabolico del siero, contrariamente ad altri metodi diagnostici che forniscono una misura della probabilità di sviluppare una determinata malattia. Terzo, è una tecnica rapida e ragionevolmente economica che può essere automatizzata in modo conveniente, richiedendo pochissime quantità di campioni di siero o altri fluidi biologici.
D’altra parte, alcuni problemi devono essere affrontati a breve termine:

• sviluppare metodi analitici appropriati per estrarre informazioni preziose dai termogrammi del siero;
• stabilire una correlazione tra le caratteristiche differenziali tra termogrammi sierici e biomarcatori fisiologici;
• esplorare l’uso di altri tipi di campioni (ad es. saliva, liquido spinale cerebrale, urina, lacrime..).

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Riferimenti bibliografici

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