Una serie di fattori nella raccolta dei campioni di EVs possono influenzare le EVs stesse dal punto di vista quantitativo e qualitativo: ad esempio nella pre-elaborazione (cioè prima di specifiche fasi di separazione/concentrazione delle EVs) e nella conservazione delle EVs.

Alcune considerazioni relative a questi fattori sono comuni a molte fonti di EVs, come ad esempio:

• massimizzare (e misurare) la qualità del materiale di partenza;
• riportare tutte le caratteristiche rilevanti del donatore per i campioni di fluidi biologici;
• misurare la quantità e la qualità del materiale di partenza come base per i dati raccolti durante la caratterizzazione delle EV;
• standardizzare e segnalare le variabili della fase di pre-elaborazione.

Altre raccomandazioni possono essere specifiche alla fonte di partenza, come ad esempio l’eliminazione di contaminanti/co-isolati specifici e la metodica per verificare la loro rimozione.

Riportiamo qui di seguito un riassunto delle raccomandazioni del MISEV2023 per il trattamento di vescicole extracellulari provenienti da varie sorgenti.

Raccomandazioni per EVs da terreno di coltura cellulare

Le raccomandazioni contenute nel MISEV2018 (Thery et al., 2018) sono ancora pertinenti. Queste includono, ma non solo:

• la segnalazione della composizione e della preparazione del terreno di coltura;
• le caratteristiche delle cellule prodotte, tra cui l’identità, la densità di semina e di raccolta e la vitalità al momento della raccolta;
• le condizioni di coltura, tra cui il recipiente/sistema, il rivestimento superficiale (se presente), la temperatura e le concentrazioni di gas;
• gli eventuali stimoli/trattamenti fisici o chimici;
• la frequenza, gli intervalli e il metodo di raccolta del CCM (Cellculture-conditioned medium);
• l’eventuale conservazione del CCM prima della separazione delle EVs;
• Se le cellule provengono da una fonte primaria, piuttosto che da una linea cellulare consolidata, riportare le condizioni di raccolta e di pre-coltura, come la digestione enzimatica;
• Se vengono utilizzati siero, lisato piastrinico o altri additivi complessi, riportare la fonte e la percentuale del terreno di coltura totale. Se viene effettuata la deplezione delle EVs di tali additivi, riportare il metodo e il grado di deplezione (compresa la diluizione, che può essere necessaria prima dei metodi di deplezione che prevedono la centrifugazione) utilizzando gli stessi metodi impiegati per caratterizzare le EVs; rilasciate. Anche i fornitori di integratori impoveriti di EVs sono incoraggiati a riferire il metodo e il grado di impoverimento delle EVs;
• Si dovrebbe prevedere l’analisi di controlli di terreni non condizionati per valutare il potenziale contributo del terreno stesso alla popolazione totale di EVs.

Raccomandazioni per EVs da Batteri

• Oltre ai parametri già indicati relativi alle condizioni di coltura, riportare la fase di crescita batterica al momento della raccolta;
• Limitare la conservazione prima della separazione/concentrazione delle EVs, soprattutto se i campioni non vengono filtrati;
• Quando si recuperano EVs batteriche da fonti in vivo e ambientali, si deve considerare che è probabile la presenza di EVs dell’ospite o di EVs di specie non target;
• Lipopolisaccaridi, LPS, e l’acido lipotecico, LTA, sono noti e diffusi marcatori di batteri gram-negativi e positivi, rispettivamente, con reagenti di affinità ben caratterizzati e disponibili in commercio. Non sono ancora disponibili invece per molte specie marcatori specifici per EVs e strutture non EVs;
• I co-isolati non vescicolari delle EVs batteriche possono includere pili, flagelli, fagi e complessi proteici, lipoproteici e nucleoproteici.

Raccomandazioni per EVs da sangue

• Le EVs provenienti da sangue sono tra le più studiate, gli effetti delle caratteristiche del donatore sono quindi particolarmente importanti da considerare e segnalare. Ad esempio, le particelle lipoproteiche di grandi dimensioni, come i chilomicroni, hanno concentrazioni elevate dopo l’assunzione con la dieta; per ridurre al minimo la loro influenza, raccogliere sangue da donatori a digiuno;
• Quando il sangue viene raccolto tramite venipuntura, utilizzare il calibro dell’ago più grande possibile per ridurre al minimo l’attivazione piastrinica e l’emolisi. Per ridurre al minimo la contaminazione batterica e delle cellule epiteliali ed evitare l’attivazione piastrinica mediata dal fattore tissutale, può anche essere una buona pratica scartare un piccolo volume del prelievo di sangue (ad esempio, per i prelievi di sangue umano, i primi 2-3 ml);
• Scegliere provette/anticoagulanti compatibili con le analisi a valle;
• Dopo il prelievo, ridurre al minimo l’attivazione piastrinica e il rilascio di EVs evitando l’agitazione eccessiva e le basse temperature e separando plasma o siero il più velocemente possibile;
• Utilizzare un protocollo di preparazione del plasma o del siero che rimuova efficacemente le piastrine ma non le EVs. Se si utilizza la centrifugazione, prelevare il surnatante dall’alto verso il basso con una pipetta, lasciando una quantità specifica di plasma o siero sopra il pellet per evitare di disturbare il pellet e rilasciare le piastrine;
• È importante determinare e riportare l’arricchimento delle EVs relativamente ai principali contaminanti/co-isolati delle EVs del sangue tra cui piastrine, lipoproteine, prodotti dall’emolisi e proteine solubili/aggregate, come le RNP (ribonucleoprotein);
• Completare lo strumento di reportistica MIBlood-EV e allegarlo come materiale supplementare a qualsiasi manoscritto che preveda una ricerca con campioni di sangue. Il documento compilato deve essere aggiunto alla cartella condivisa MIBlood-EV (dettagli: https://www.isev.org/rigor-standardization).

Raccomandazioni per EVs da urina

• L’urina è il secondo biofluido più analizzato dopo il sangue e può essere ottenuta in modo non invasivo, in serie e in grandi quantità. Si consiglia di seguire le raccomandazioni ISEV pubblicate in precedenza (Erdbrügger et al., 2021; van Royen et al., 2023);
• Eseguire la ricerca sugli uEV utilizzando urine e biobanche di urine prive di cellule;
• Se rilevante, riportare la metodologia e i risultati della deplezione di co-isolati /contaminanti delle uEV (THP, albumina e altre proteine filtrate dal siero);
• Per la normalizzazione, raccogliere dati sia sugli uEV che sui parametri urinari non uEV (ad esempio, creatinina, PSA o altri, a seconda dei casi) per stimare i tassi di escrezione assoluti o relativi.

Raccomandazioni per EVs da liquido cerebrospinale

• Segnalare il sito anatomico di prelievo e il volume del liquido cerebrospinale prelevato visto la possibile influenza del gradiente rostrale-caudale;
• Misurare i livelli di co-isolati/contaminanti specifici, come cellule e proteine del sangue, e stabilire criteri di esclusione se appropriati, ad esempio >500 eritrociti/μL da studi sui biomarcatori;
• I metodi di separazioni ad alta resa e i metodi di caratterizzazione ad alta sensibilità sono particolarmente importanti per lo studio delle EVs del liquido cerebrospinale;
• Considerare il pooling dei campioni per avere volumi adeguati.

Raccomandazioni per EVs da saliva

• Riportare chiaramente la fonte della saliva (intera o da una ghiandola specifica), il metodo utilizzato per la raccolta e qualsiasi stimolo utilizzato;
• Standardizzare l’assunzione di cibo e bevande prima del prelievo o, come minimo, valutare questi fattori al momento del prelievo.

Raccomandazioni per EVs da fluido sinoviale

• Considerare l’uso della ialuronidasi per ridurre la viscosità e ottenere un liquido sinoviale omogeneizzato prima della separazione e della caratterizzazione delle EVs.

Raccomandazioni per EVs da latte

• Mantenere il latte a temperatura corporea per conservazione a breve termine prima della conservazione a lungo termine o della estrazione delle EVs;
• Le componenti più comunemente co-isolate di EVs da latte includono cellule, globuli di grasso del latte e micelle di caseina. Questi devono essere rimossi (e/o, nel caso delle micelle, disgregati) e la loro presenza deve essere monitorata durante il processo di separazione delle EVs.

Raccomandazioni per EVs da tessuto solido

• Per le colture ex vivo, mantenere il tessuto il più vicino possibile alle sue condizioni “native”, anche mantenendo idratazione e nutrizione. Considerare anche l’influenza dei processi di morte cellulare sulla preparazione delle EVs;
• Per la separazione delle EVs direttamente dal tessuto (senza coltura ex vivo), stabilire o seguire le migliori pratiche per il tessuto specifico nella raccolta, ad esempio:
  • perfusione o meno di un modello animale per ridurre al minimo gli effetti del sangue;
  • conservazione (il congelamento influisce sui risultati?);
  • separazione fisica ed enzimatica del tessuto (se effettuata) e influenza dei metodi specifici di separazione/concentrazione delle EVs.
• La caratterizzazione delle EVs tissutali deve concentrarsi in particolare sul rilevamento della presenza di componenti cellulari che potrebbero essere impoveriti nelle EVs, poiché le cellule e gli artefatti cellulari possono essere i principali contaminanti delle preparazioni di EVs tissutali.

Con questo articolo continua la serie di contenuti dedicati al MISEV 2023, con lo scopo di fornire una fonte di informazioni in lingua italiana. Seguiteci su nostro canale Linkedin per essere informati delle nuove pubblicazioni!