“EVs should be studied in as native a form as possible”.
Con questa affermazione riportata nell’ultimo Report MISEV2023 si è voluto porre attenzione sulla complessità degli step di separazione ed eventualmente di concentrazione necessari alla maggior parte delle tecniche attualmente impiegate per la caratterizzazione di vescicole extracellulari. Questi step preparativi normalmente avvengono sfruttando caratteristiche biofisiche come dimensione, densità, carica e composizione superficiale (come la presenza di specifiche molecole superficiali).
Prese singolarmente però, queste caratteristiche non è detto che siano sufficienti a garantire un corretto e completo isolamento e arricchimento della popolazione di EVs di interesse, con il rischio che le tecniche di caratterizzazione a valle siano affette da bias analitici.
Figura 1. Distribuzione dimensionale fenotipo-specifica
Leprechaun determina la concentrazione delle Evs mediante un approccio fenotipo-specifico su marcatori interni o esterni, ed in colocalizzazione di un massimo di quattro proteine rendendo ancora più stringente l’output analitico.
Figura 2. (Sx) Pittogramma rappresentativo del principio su cui si basa il disegno sperimentale (Dx) Istogramma riportante la concentrazioni totale e per ciascun marcatore di cattura.
Le tetraspanine CD9, CD81 e CD63 sono le più impiegate nei protocolli basati sull’affinità ma è risaputo che sebbene ubiquitari, non sono marcatori esosomiali specifici, inteso come sottopopolazione di EVs, e che, sebbene sia raro, non tutte le EVs presentano questi marcatori superficiali rappresentando un potenziale limite dal momento che non è garantita una sovrapposizione molecolare mediante l’uso di queste sonde. Per superare questa potenziale limitazione è possibile personalizzare il test utilizzando i propri anticorpi di rilevazione e/o cambiare il marcatore di cattura utilizzando un kit Flex che consente di aggiungerne fino ad ulteriori 2, specifici per la sottopopolazione di interesse, sempre senza purificazione e su pochissimi μL di campione.
Figura 3 Rappresentazione schematica del chip Flex. Grazie a reagenti specifici inclusi nel kit, un linker viene aggiunto ai propri anticorpi specifici per poi poter essere immobilizzati sulla superfice dei chip.
Tramite l’approccio Flex diventa quindi ancora più accessibile la soddisfazione del requisito indicato dalle linee guida MISEV per quanto riguarda la caratterizzazione delle EVs per la loro composizione proteica al paragrafo 5.7 e relativa Tabella 3: At least one protein of categories 1, 2 and 3 should be analysed as EV hallmarks and to assess the presence of NVEPs in an EV preparation. Analysis of proteins of category 4 is optional, as they may be present in some subtypes of EVs, or under certain conditions, with no general rule. Proteins of category 5 may bind to EVs after their release and may be part of the recently described EV ‘corona’.
