La piattaforma Nanoimager permette la visualizzazione, la quantificazione e il tracciamento delle EVs al livello di singola molecola, sia in soluzione che in cellule vive. Questo tipo di analisi dell’EVs permette di determinarne e studiarne:

• grandezza, concentrazione e numero di particelle nella soluzione
• biogenesi
• internalizzazione in cellule vive
• movimento intracellulare e interazione con i componenti cellulari
• rilascio
• ruolo nella comunicazione tra cellule

Sfida

Le vescicole extracellulari (EVs) giocano un ruolo chiave nella comunicazione inter-cellula. Le EVs possono superare delle barriere biologiche (come, ad esempio, la barriera emato-encefalica) ed essere internalizzate con un altro grado di specificità. Per queste ragioni le EVs sono seriamente prese in considerazione per lo sviluppo come agenti terapeutici, veicoli per il drug delivery, e per essere sfruttate come biomarkers diagnostici.

Le EVs sono eterogenee in dimensioni con le più piccole che possono arrivare ad avere un diametro approssimativamente compreso tra i 30 e 120nm, ben al di sotto delle capacità di risoluzione spaziale della microscopia ottica convenzionale. La sorte e le interazioni delle EVs all’interno delle cellule sono anche per questo difficili da studiare.
L’alto potere risolutivo delle tecniche di microscopia elettronica è purtroppo limitato allo studio di cellule e tessuti fissati, rendendole così pressoché inutili per il tracciamento dei movimenti delle EVs in tempo reale all’interno delle cellule vive.

Nanoimager e AploScope invece offrono misure per la determinazione di dimensione e concentrazione delle particelle – in stile NTA – , e per il tracciamento delle singole particelle in cellula. Le EVs possono infatti essere immunomarcate e caratterizzate inizialmente in soluzione, per essere  seguite durante e dopo l’uptake in cellule vive. Le 4 linee laser ed il set di filtri messi a disposizione da questi due strumenti permettono flessibilità nella marcatura sia delle EVs che di strutture sub-cellulari.

Risultati

Nanoimager e AploScope sono in grado di offrire una vasta gamma di funzionalità di imaging, consentendo di utilizzare una combinazione di approcci per l’indagine delle dinamiche e delle interazioni delle EV.

Nel seguente esempio, le EVs sono state prima isolate da linee cellulari di linfoma di Burkitt umano, etichettate con AlexaFluor™ 674, ed infine purificate mediante cromatografia SEC. Il rilevamento automatico delle particelle e la funzione di sizing sono utilizzate per misurare concentrazione  e diametro di Stokes delle vescicole presenti in soluzione. Nell’immagine di esempio, le tracce sono state colorate in base ai coefficienti di diffusione, e sovrapposte a un’immagine widefield di una singola EV, estrapolata da uno dei 1000 fotogrammi dell’acquisizione (segnale rosso) (Figura 1A). Le distribuzioni dimensionali analizzate per le EV purificate in soluzione sono risultate piuttosto ampie, con un picco massimo intorno ai 120 nm (Figura 1B).

Figura 1. Tracciamento delle EV in soluzione. (A) Esempi di tracce colorate in base ai coefficienti di diffusione. Il segnale rosso mostra un’immagine widefield di una singola EV, estrapolata da uno dei 1000 fotogrammi dell’acquisizione. (B) Grafico che presenta la distribuzione dimensionale delle EV purificate e marcate in modo non specifico con AF647. Campione proveniente dal laboratorio del prof. C. Gregory, Università di Edimburgo.

Successivamente, le popolazioni di vescicole purificate sono state incubate con cellule endoteliali della vena ombelicale umana per diverse ore, dando loro sufficiente tempo per essere internalizzate. I movimenti post-internalizzazione delle EVs all’interno della cellula sono stati tracciati e rappresentati in un’immagine (Figura 2). La visualizzazione delle tracce, la loro lunghezza, la distribuzione (un esempio delle quali è mostrato nel pannello A) e i coefficienti di diffusione (pannello B) indicano che le vescicole sono più lente nell’area circostante il nucleo e più veloci nella periferia della cellula.

Immagine 2. Tracciamento delle EV in cellule vive. (A) EVs (marcate in modo non specifico con AF488) in cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Le singole tracce sono state colorate in base ai loro coefficienti di diffusione. Inserto: fotogramma di esempio che mostra l’immagine widefield delle EV nella cellula; le linee tratteggiate rappresentano i contorni della cellula e del nucleo. (B) Grafico che mostra la distribuzione dei coefficienti di diffusione nella ROI selezionata (quadrato bianco all’interno dell’inserto).

Soluzioni con il Nanoimager

Nanoimager e AploScope rappresentano la prima linea di microscopi da banco al mondo con capacità di tracciamento a singola particella. Con la capacità di visualizzare, tracciare e quantificare le singole EV sia in soluzione che nelle cellule viventi, forniscono informazioni dettagliate sul loro comportamento e sulle interazioni con le cellule. La comprensione di questi meccanismi è fondamentale per lo sviluppo di strategie efficaci per la somministrazione di farmaci mediata dalle EV e di nuove terapie per varie malattie.

Visita le pagine dedicate al Nanoimager e all’AploScope per saperne di più sulle caratteristiche di questi microscopi, sulle loro diverse applicazioni.