Tecniche analitiche per una nuova stagione terapeutica: vincere la sfida dei biologi moderni (parte 2 – Dynamic Light Scattering DLS)

Introduzione

Ad oggi, i farmaci biologici moderni – come proteine ricombinanti e anticorpi monoclonali – rappresentano una svolta nel campo della biofarmaceutica, permettendo trattamenti terapeutici sempre più mirati, efficaci e in alcuni casi addirittura curativi. Tuttavia, questa evoluzione porta con sé una crescente complessità dal punto di vista analitico.

Rispetto alle small molecules, i prodotti farmaceutici di natura biologica sono sistemi più delicati e sensibili alle condizioni ambientali. Attributi di qualità come dimensione, stato di aggregazione e stabilità conformazionale non sono semplici parametri descrittivi, ma elementi critici che influenzano sicurezza, efficacia e producibilità del farmaco.

Proprio per questo motivo, disporre di tecniche rapide, poco invasive e a basso consumo di campione è cruciale. La Dynamic Light Scattering (DLS) si è affermata come uno strumento estremamente versatile, evolvendosi da tecnica prevalentemente accademica a tecnologia ampiamente impiegata per lo screening di bioformulazioni, in grado di fornire informazioni immediate sul comportamento colloidale di proteine terapeutiche e di supportare la valutazione della loro stabilità a lungo termine.

Dynamic Light Scattering (DLS)

La Dynamic Light Scattering (DLS) è una tecnica di scattering ottico, non invasiva, utilizzata per determinare la dimensione idrodinamica di particelle e macromolecole in soluzione, coprendo un intervallo dimensionale che va da pochi nanometri fino al sub-micrometro.

La tecnica si basa sul principio secondo cui le particelle disperse in soluzione sono soggette a moto browniano e, quando illuminate da una sorgente laser, diffondono la luce in modo dipendente dalla loro dimensione. Particelle più piccole presentano movimenti più rapidi, mentre specie di dimensioni maggiori mostrano un moto più lento.

Analizzando nel tempo le fluttuazioni dell’intensità della luce diffusa, è possibile risalire alla velocità di diffusione delle particelle e quindi al loro raggio idrodinamico, che rappresenta la dimensione apparente delle specie in soluzione.

I principali parametri ottenuti da una misura DLS sono:

• Z-‑average: la dimensione media idrodinamica pesata in intensità, particolarmente robusta e riproducibile, ideale per confronti comparativi.
• Indice di polidispersità (PdI): un parametro che descrive l’ampiezza della distribuzione dimensionale, fornendo indicazioni qualitative sull’eterogeneità del campione e sulla possibile presenza di specie multiple.

Figura 1. Principio di misura della Dynamic Light Scattering: fluttuazioni di intensità per una soluzione di particelle disperse in funzione del tempo.

Figura 2. Esempio di curve di DLS per ovalbumina (blu) a 6 nm e biossido di silicio (rosso) a 95 nm. L’ovoalbumina, di dimensione minore, diffonde più rapidamente, mostrando un decadimento più veloce del segnale rispetto al biossido di silicio.

Perché la DLS è importante per le proteine terapeutiche?

Nel contesto dello sviluppo di prodotti biologici, la dimensione e lo stato fisico delle proteine in soluzione rappresentano indicatori chiave della loro stabilità e qualità.

La formazione di aggregati proteici, anche in quantità molto basse può insorgere in condizioni apparentemente controllate e avere un impatto significativo su sicurezza, efficacia e riproducibilità del prodotto finale. In questo senso, la DLS trova ampia applicazione come strumento di screening rapido per l’identificazione precoce di fenomeni di aggregazione o oligomerizzazione. Grazie alla sua elevata sensibilità, consente di rilevare variazioni dimensionali anche minime, fornendo un primo segnale di potenziale instabilità della formulazione.

La DLS è inoltre ampiamente utilizzata durante le fasi di ottimizzazione formulativa e nei stress test, ad esempio in funzione di variazioni di pH, forza ionica, concentrazione proteica o condizioni di stress termico (da 0 a 120 °C con i nuovi strumenti Zetasizer Advance!)  e meccanico. Il confronto rapido tra campioni permette di valutare l’effetto di queste variabili sul comportamento colloidale della proteina, supportando la selezione delle condizioni formulative più adeguate.

Infine, lungo il percorso che va dalla ricerca alla produzione, la DLS può essere impiegata come strumento di supporto al controllo di qualità, offrendo una verifica veloce e non distruttiva del prodotto e contribuendo a monitorarne la stabilità nel tempo, evidenziando deviazioni potenzialmente critiche prima che diventino problematiche.

La DLS come “early warning” nel contesto di altre tecniche biofisiche

La DLS è una tecnica analitica vantaggiosa, ma presenta anche alcune limitazioni: non fornisce informazioni strutturali dettagliate e non consente di risolvere con elevata precisione miscele complesse di specie di dimensioni simili. Con le ultime evoluzioni della tecnologia sugli strumenti Zetasizer Advance, in configurazione Ultra, è possibile eseguire misure multi-angolo impiegando la tecnologia MADLS che consente di aumentare la risoluzione passando da un fattore 1:3 della DLS ad angolo singolo fino a 1:2 aumentando così notevolmente il contributo informativo anche nell’ambito di veloci misure esplorative.

Figura 3. Confronto tra misura a singolo angolo e nuova tecnologia MADLS.

È proprio qui che emerge il valore dell’ortogonalità analitica. Non esiste infatti uno strumento perfetto, ma combinazioni di tecniche complementari che, se utilizzate in modo sinergico, permettono di ottenere una comprensione più completa del sistema.

In questo senso, la DLS si inserisce come tecnica di primo livello, rapida e informativa, in grado di guidare le decisioni sperimentali successive. I risultati ottenuti possono essere affiancati ad approcci biofisici complementari, capaci di fornire informazioni più specifiche su parametri quali concentrazione, conformazione, stabilità termica o composizione, spesso mediante tecniche più complesse o time‑consuming.

Piattaforme analitiche di nuova generazione hanno la DLS può essere affiancata ad altri sistemi di rilevazione come la spettrofotometria UV/VIS nello strumento Stunner o la DSF nello strumento Aunty, entrambi di Unchained Labs, per completare il pannello informativo e ottenere risultati completi e sinergici più velocemente.

Stunner di Unchained Labs è la piattaforma “all‑in‑one” per la caratterizzazione di proteine che combina, sullo stesso campione da soli 2 µL, misure UV/Vis ad alta accuratezza e Dynamic Light Scattering ad alto throughput in formato piastra. L’assorbanza UV/Vis fornisce una quantificazione estremamente precisa della concentrazione proteica su un ampio intervallo, mentre il DLS misura in parallelo dimensione, polidispersione e presenza di aggregati, permettendo di valutare in un’unica corsa qualità, stabilità colloidale e comportamento in soluzione. Integrando questi due read‑out, Stunner collega direttamente concentrazione, stato di aggregazione e parametri come kD e B22, offrendo una lettura completa.

Figura 4. Analisi simultanea mediante strumento Stunner di spettro UV/VIS e distribuzione dimensionale DLS mediante piattaforma Stunner di ADC. La spettrofotometria UV/VIS a spettro completo, combinata con i potenti algoritmi UNMIX, consente di monitorare concentrazione di Ab, concentrazione di molecole coniugata e distribuzione dimensionale del costrutto molecolare.

Aunty di Unchained Labs invece è la piattaforma ad altissimo throughput per la stabilità delle proteine che combina in un’unica piastra da 96 pozzetti fluorescenza full‑spectrum (DSF), Static Light Scattering (SLS) e Dynamic Light Scattering (DLS) su soli 8 µL di campione. La fluorescenza monitora in tempo reale l’unfolding e definisce con precisione le temperature di melting, mentre SLS e DLS seguono in parallelo l’insorgenza e la crescita degli aggregati, fornendo informazioni su inizio dell’aggregazione, cinetica e dimensione degli aggregati durante la rampa termica. Integrando questi tre read‑out sulla stessa curva di temperatura, Aunty collega direttamente Tm e Tagg, distinguendo condizioni che stabilizzano la struttura nativa da quelle che favoriscono l’aggregazione, e permette di selezionare rapidamente formulazioni, varianti e condizioni più robuste per lo sviluppo di bioterapeutici.

Figura 5. Negli studi formulativi poter correlare simultaneamente stabilità colloidale e conformazionale temperatura di melting, t_agg e t_size) è molto importante per accelerare lo sviluppo e comprendere meglio i meccanismi di stabilizzazione che diversi tipi di buffer possono comportare.

In un panorama in cui i biofarmaci diventano sempre più complessi, la DLS si conferma un tassello fondamentale per comprendere il comportamento delle molecole in soluzione e prevenire problemi di stabilità lungo l’intero ciclo di sviluppo. Integrata con tecniche complementari – dalla spettroscopia UV/Vis alla fluorescenza e alla light scattering statica – la DLS trasforma un semplice dato di dimensione in un quadro ricco e coerente su aggregazione, stabilità e developability. Questa visione multi‑parametrica non solo rende le decisioni di formulazione più rapide e robuste, ma permette anche di ridurre rischi e costi, portando in clinica biofarmaci più sicuri, stabili e di qualità superiore.