I detectors di light scattering si basano sull’equazione di Rayleigh che stabilisce che l’intensità di scattering è direttamente proporzionale al peso molecolare (l’intensità di scattering è uguale alla costante ottica per la concentrazione per il peso molecolare).
Sempre secondo l’equazione di Rayleigh, l’intensità di scattering deve essere misurata ad angolo zero. Siccome risulta impossibile rivelare l’intensità di scattering al livello della luce incidente (angolo zero), l’intensità di scattering ad angolo zero viene stimata usando uno dei seguenti metodi:
- misura dell’intensità di scattering a basso angolo – Low Angle Light Scattering. Al di sotto di 10°, l’errore rispetto all’angolo zero diventa trascurabile
- misura dell’intensità di scattering a vari angoli ed estrapolazione a zero della curva di light scattering vs. angolo.
RALS: ideale per Proteine e Piccoli polimeri
Le molecole di dimensione inferiore ad un decimo della lunghezza d’onda (ca. 15 nm, ca. < 200kDa per polimeri lineari, < 1 milione Da per proteine globulari) scatterano la luce in modo isotropico, ovvero identico a qualsiasi angolo. In quel caso, l’intensità di scattering potrebbe essere in teoria misurata a qualsiasi angolo. Il migliore rapporto segnale/rumore nel caso delle proteine e piccole molecole è ottenuto a 90°, quindi un detector Right Angle Light Scattering RALS rappresenta una soluzione ottima per questa tipologia di campioni.
LALS: ideale per grandi Polimeri e Macromolecole
Per le molecole di dimensione superiore ad 1 decimo della lunghezza d’onda, l’intensità di scattering presenta una dipendenza angolare, ovvero l’intensità di scattering varia con l’angolo al quale viene misurata. Il metodo più semplice e diretto consiste nella misura dell’intensità di scattering all’angolo più vicino possibile a zero, ovvero 7° o Low Angle Light Scattering LALS. Il detector Low Angle Light Scattering della Malvern beneficia di un brevetto della Viscotek che usa uno specchio forato per raccogliere la luce scatterata il più vicino possibile all’angolo zero (7°), senza essere abbagliato dalla luce incidente.
MALS: la soluzione universale
Con un detector Multi Angle Light Scattering MALS, l’intensità rilevata ai vari angoli e l’informazione sulla concentrazione ottenuta da un secondo detector (tipicamente UV o Indice di Rifrazione) sono combinate per costruire un grafico, il quale è usato in due differenti modi:
- Per estrapolare il dato con cui determinare l’intensità della luce scatterata ad angolo zero, dal quale viene calcolato il peso molecolare assoluto. Per le grandi molecole, l’estrapolazione non è lineare e i dati vanno fittati con un’appropriata funzione matematica.
- Per determinare la pendenza iniziale della curva risalendo al raggio di girazione delle molecole (Rg).
Se la configurazione del sistema include anche un detector di viscosità, la combinazione dei dati di peso molecolare e di viscosità intrinseca può essere utilizzata per calcolare il raggio idrodinamico (Rh) ed ottenere informazioni sulla ramificazione della molecola.
