Molecole chirali sono immagini speculari o enantiomeri. Queste molecole non sono sovrapponibili in nessun modo, cioè mediante qualsiasi manipolazione nello spazio 3D che non richieda la modifica dei legami presenti. Le proprietà fisiche degli enantiomeri sono identiche ad eccezione della loro interazione con la luce polarizzata o con altre molecole chirali.
Il Dicroismo Circolare (CD), misurato in funzione della lunghezza d’onda, è la differenza nell’assorbimento tra la componente destra (R-CLP) e quella sinistra (L-CLP) della luce polarizzata circolarmente.
Questa differenza può essere rilevata quando una molecola contiene uno o più gruppi chirali che assorbono la luce – i cosiddetti cromofori chirali.
Circular dichroism (CD) = ΔA(λ) = A(λ)L-CPL – A(λ)R-CPL, dove λ è la lunghezza d’onda
Molti amminoacidi sono molecole chirali e questo consente l’utilizzo del Dicroismo Circolare come tecnologia per lo studio di proteine e biomolecole.
Quando dei componenti chirali cromofori sono presenti, uno degli stati della luce polarizzata circolarmente viene assorbito con maggiore intensità rispetto all’altro. A parità di lunghezza d’onda, un segnale CD può quindi essere positivo o negativo, a seconda che la componente sinistra L-CLP sia assorbita di più o di meno rispetto alla componente destra R-CLP (segnale positivo o negativo).
Gli spettrometri CD Chirascan misurano alternativamente ad ogni lunghezza d’onda l’assorbimento della componente destra R-CLP e sinistra L-CLP per calcolarne la differenza ovvero il segnale CD. Gli spettri CD variano quindi in conseguenza ai diversi assorbimenti portando alla visualizzazione di diversi picchi, positivi quando L-CLP > R-CLP o negativi quando L-CLP < R-CLP, in funzione delle diverse lunghezze d’onda.
Entrando nello specifico dello studio delle proteine:
I legami disolfuro, spesso presenti, influenzano entrambi gli spettri CD nel lontano- e vicino-UV.
Il cromoforo chirale che domina nel lontano-UV è il legame peptidico carbonilico (C=O):
π → π* a ~ 190 nm; n → π* a ~ 210-230 nm.
Nel vicino-UV invece sono gli amminoacidi aromatici a dominare il segnale CD
CD e higher order structure (HOS) di biomolecole
La maggior parte delle biomolecole sono chirali, con una Higher Order Structure (HOS) che presenta cromofori chirali. Per esempio, 19 degli amminoacidi maggiormente presenti nelle proteine sono chirali. L’effetto sinergico di tutti gli elementi chirali presenti in una molecola genera un caratteristico spettro CD che rappresenta l’impronta digitale della molecola stessa. Questo spettro può essere utilizzato per identificare elementi strutturali e seguire cambiamenti nella struttura superiore delle macromolecole.
La struttura delle proteine è particolarmente sensibile ai cambiamenti delle condizioni chimico-fisiche dell’ambiente in cui sono disperse, come pH o temperatura, e all’interazione con altre molecole/strutture come ligandi, destabilizzanti o nanoparticelle. Processi di glicosilazione o differenti stati di ossidazione possono influenzare a loro volta la HOS.
Cambiamenti nello spettro CD di biomolecole sono quindi indicativi di alterazioni nella struttura secondaria e/o terziaria. Questi cambiamenti possono influenzare caratteristiche come la stabilità e l’attività biologica, come rivelare lo stato conformazionale della proteina.
Struttura secondaria di Human insulin (sinistra) e Monoclonal antibody (mAb) (destra)
Sebbene gli spettrometri CD Chirascan possano analizzare qualsiasi tipo di molecole chirali sono stati ottimizzati per permettere lo studio approfondito della struttura secondaria e terziaria, così come l’ottenimento di informazioni cinetiche e termodinamiche, di proteine e altre biomolecole chirali.
La sensibilità degli spettrometri CD Chirascan permette di rilevare similarità e differenze nella comparazione di diverse molecole o l’effetto dell’esposizione a diverse condizioni. Per esempio, un’analisi CD può dimostrare se una proteina purificata è correttamente ripiegate, determinare se una proteina mutante è ripiegata correttamente rispetto al wild-type o consentire il confronto dei candidati bioterapeutici durante lo sviluppo del farmaco.
Struttura secondaria, far-UV, rampa di temperatura 25-95°C, Chirascan
