La tecnica DSF, acronimo di Differential Scanning Fluorimetry, è una metodologia analitica utilizzata per studiare le interazioni tra molecole biologiche e molecole leganti ma anche per la caratterizzazione strutturale di biomolecole come proteine e acidi nucleici attraverso misurazioni di variazioni di fluorescenza. Questa tecnica sfrutta il principio secondo cui la presenza di un legante può alterare le proprietà di fluorescenza di una molecola target, consentendo di studiare la loro affinità e stabilità. La DSF trova ampio impiego in ambito biotecnologico e farmaceutico per caratterizzare interazioni molecolari, quali legame ligando-recettore o interazioni proteina-proteina, fornendo informazioni cruciali per lo sviluppo di farmaci e la comprensione dei meccanismi biologici.
Nel contesto della caratterizzazione strutturale invece, la DSF sfrutta variazioni di fluorescenza indotte da cambiamenti nella struttura della molecola target, come ad esempio la denaturazione termica delle proteine o la dissociazione di complessi molecolari. Misurando le variazioni di fluorescenza al variare della temperatura, è possibile ottenere informazioni dettagliate sulla stabilità e sulla struttura della molecola in esame. Questa metodologia trova ampio impiego nella determinazione di parametri strutturali, come la temperatura di denaturazione, l’energia di legame e la termodinamica delle transizioni strutturali, contribuendo così alla comprensione dei meccanismi di funzionamento delle biomolecole e alla progettazione di terapie mirate e di nuovi farmaci.
La fluorescenza può provenire dai residui di triptofano, tirosina e fenilalanina della proteina stessa (fluorescenza intrinseca) o da un fluoroforo aggiunto come SYPRO® Orange. La “differenza” nella fluorescenza a scansione “differenziale” deriva dall’aggiunta di calore. Con la DSF, si misurano i cambiamenti nella fluorescenza quando una proteina si dispiega in risposta alle temperature più elevate di una rampa termica.
Per le proteine, la forma della fluorescenza emessa dipende dall’ambiente locale intorno agli aminoacidi fluorescenti. Lo spettro di fluorescenza di una proteina ripiegata con tasche idrofobiche altamente non polari avrà un aspetto diverso dallo spettro di una proteina non ripiegata con gli aminoacidi fluorescenti esposti a un ambiente acquoso meno polare.
Un esperimento DSF consente di determinare diversi parametri del processo di denaturazione come la temperatura di Onset (Tonset), il momento in cui le proteine iniziano a denaturarsi e altri punti di flessione (Tm1, Tm2) che rappresentano le temperature a metà degli eventi di unfolding.
