Calorimetria a scansione differenziale
La calorimetria a scansione differenziale (Differential Scanning Calorimetry DSC) è una tecnica indispensabile per la caratterizzazione della stabilità delle proteine e di qualsiasi altra biomolecola nella loro forma nativa. Il principio di funzionamento è basato sulla misura diretta del calore assorbito, associato alla denaturazione di una biomolecola quando questa viene sottoposta ad un test di stress termico.
Qualsiasi biomolecola in soluzione si trova in equilibrio tra il suo stato nativo e la conformazione denaturata. La stabilità della biomolecola è descritta dal punto di transizione termica (Tm) che rappresenta la temperatura alla quale il 50% della proteina è presente nel suo stato denaturato. Più alto è il punto di transizione termica (Tm) più la biomolecola risulterà essere termicamente stabile.
La DSC è l’unica tecnica universale e generica capace di determinare la stabilità termica con interpretazione diretta del risultato. La DSC permette di approfondire i fattori che contribuiscono alla stabilità della biomolecola tra cui: interazioni idrofobiche, legami idrogeno, entropia conformazionale e parametri fisici dell’ambiente.
Prinicipio di misura
Qualsiasi biomolecola, come proteine, acidi nucleici e lipidi, è caratterizzata da una precisa struttura che può andare in contro a trasformazioni conformazionali indotte termicamente. Questi riarrangiamenti strutturali risultano in un assorbimento di calore causato dalla ridistribuzione di legami deboli. La DSC misura questo assorbimento di calore.
Il microcalorimetro DSC è costituito da due celle: una cella di riferimento, che contiene il buffer, e una cella campione. Il sistema è progettato per mantenere le due celle alla stessa temperatura durante il progressivo riscaldamento. L’assorbimento di calore che si verifica quando una proteina si denatura causa una differenza di temperatura tra le due celle. Questa differenza viene compensata dal sistema (DP) per ripristinare l’equilibrio termico tra le due celle.
Il risultato finale è rappresentato da un termogramma. Il massimo del picco fornisce il valore di transizione termica Tm mentre l’entalpia del processo, misurata in calorie per mole, è calcolata dall’integrazione dell’area sottesa alla curva. Tm è indicativo della stabilità della biomolecola, qualsiasi cosa stabilizzi la proteina farà aumentare questo valore. L’entalpia del processo di denaturazione, ΔH, è invece correlata alle energie coinvolte e quindi alle forze che governano il processo. Parallelamente è possibile ottenere altri parametri descrittivi associati alla transizione come l’energia libera di Gibb (ΔG), entalpia calorimetrica (ΔHcal) e di Van’t Hoff (ΔHvH), l’entropia (ΔS) e la variazione di capacità termica (ΔCp)
Le applicazioni della DSC
- La microcalorimetria a scansione differenziale trova largo impiego nella ricerca farmacologia, specialmente nel settore bioterapico e nello sviluppo di vaccini.
- Caratterizzazione della stabilità delle proteine fin dalle prime fasi dello sviluppo
- Eliminare candidati con possibili problemi di stabilità a lungo termine
- Ottimizzazione dei processi di purificazione e produzione
- Determinazione delle condizioni ottimali di formulazione. Riduzione del numero di formulazioni testate in fasi avanzate di sviluppo del prodotto
- Misura della stabilità dei complessi proteici e dell’effetto di interazioni sulla stabilità della biomolecola
Vantaggi della tecnica
- DSC è una tecnica universale e generica
- È l’unico metodo di determinazione della stabilità termica con interpretazione diretta del risultato
- L’assenza di componenti ottiche ne permette l’impiego con soluzioni torbide/colorate
- Descrittori multipli del processo di denaturazione termica per una interpretazione completa ed esaustiva dei meccanismi che regolano il processo.
- DSC è una tecnica robusta impiegata per la validazione di altri test di stabilità termica
