Calorimetria isotermica di titolazione
La calorimetria isotermica di titolazione (ITC, dall’inglese Isothermal Titration Calorimetry) è una tecnica termodinamica impiegata per lo studio delle interazioni biomolecolari. Il principio di funzionamento è basato sulla misura diretta del calore rilasciato o assorbito durante un qualsiasi fenomeno di interazione. L’ITC è l’unica tecnica che permette di determinare, con un unico esperimento, tutti i parametri di binding molecolare. Senza la necessità di modificare le molecole mediante marcatura o immobilizzazione, l’ITC misura l’interazione tra le componenti nel loro stato nativo.
Quando due sostanze interagiscono si può generare o assorbire calore. La misura di questo calore permette l’accurata determinazione di costanti di legame (KD), stechiometria di reazione (n), entalpia (ΔH) ed entropia (ΔS), fornendo così un profilo termodinamico completo dell’interazione molecolare in un singolo esperimento. Queste informazioni consentono di andare oltre alla sola affinità di legame: disponendo di una rappresentazione completa e dettagliata del profilo termodinamico dell’interazione è infatti possibile approfondire i meccanismi chimico-fisici che governano il fenomeno a livello molecolare. Questa più profonda comprensione della relazione struttura-attività fornisce un valido supporto in qualsiasi processo decisionale rendendosi indispensabile in processi come la selezione degli hit e l’ottimizzazione dei lead nella ricerca farmacologica.
Principio di misura
Quando si verifica un’interazione, il calore è generato o assorbito e questa variazione viene misurata dal microcalorimetro durante la graduale titolazione del ligando nella soluzione contenente la biomolecola di interesse. Il microcalorimetro è costituito da due celle: una cella di riferimento, che contiene acqua, e una cella campione. Il sistema deve mantenere le due celle esattamente alla stessa temperatura. Quando si verifica un’interazione i sensori rivelano una differenza di temperatura tra le celle inviando così un feedback allo strumento che compensa per questa differenza ripristinando l’equilibrio.
L’esperimento consiste nell’iniezione di piccole aliquote di ligando nella soluzione contenente il campione, incrementando progressivamente il rapporto molare tra le due componenti. Se si verifica un’interazione, viene rilasciato o assorbito calore in modo direttamente proporzionale all’entità del legame. Con il progredire delle iniezioni, e quindi con l’aumentare del rapporto molare, si verifica la progressiva saturazione della proteina nella cella con una conseguente riduzione del calore scambiato fino a quando la cella conterrà un eccesso di ligando raggiungendo così la saturazione della reazione e non verrà più rilevato nessuno scambio termico.
L’area di ciascun picco viene integrata e rapportata contro il rapporto molare. L’isoterma così ottenuta può essere descritta mediante diversi modelli di interazione ottenendo così i parametri descrittivi.
Le applicazioni della ITC
La calorimetria a titolazione isoterma trova applicazione in diversi settori quali farmaceutico, diagnostico, genetico, nano tecnologico ed enzimatico. Le informazioni che si possono ottenere grazie alla tecnica ITC sono di estrema importanza nel campo del drug discovery, della proteomica e in tutti quei settori dove risulta fondamentale approfondire affinità e meccanismi di interazione.
Tra le principali applicazioni si evidenziano:
- Quantificare l’affinità e la stechiometria di legame
- Validazione dei target
- Selezione e ottimizzazione dei candidati (hit-to-lead drug discovery)
- Caratterizzazione del meccanismo d’azione dell’interazione (studi SAR)
- Conferma dell’affinità in studi di pre-formulazione
- Validazione dei valori IC50 ed EC50 durante il processo di selezione hit-to-lead
- Misura delle cinetiche enzimatiche
Per la sua natura termodinamica la tecnica si presta anche allo studio di qualsiasi tipologia di interazione come ad esempio tra biomolecole e nanomateriali.
Vantaggi della tecnica ITC
- Tutti i parametri dell’interazione in un unico esperimento
- Tecnica assoluta basata sulla misura di una proprietà intrinseca del sistema osservato
- Profilo termodinamico completo ed esaustivo dell’interazione
- Impiego di molecole nel loro stato nativo, nessun marcatore o immobilizzazione
- Compatibilità con soluzione torbide, colorate e con materiale particolato in sospensione
- Experimental design estremamente semplificato
- Nessun limite nel peso molecolare degli analiti
