Microscopia a Super Risoluzione

 

Microscopia confocale
Che cos’è la microscopia confocale?

La microscopia confocale è una tecnica di microscopia a fluorescenza sviluppata allo scopo di migliorare la risoluzione delle immagini, in particolare nei campioni più spessi, rimuovendo i segnali luminosi provenienti dagli strati non a fuoco del campione. In precedenza, l’unico modo per acquisire immagini di campioni spessi era sezionarli in fette molto sottili. Non soltanto questa operazione risulta molto complicata, ma rende impossibile l’imaging di campioni vivi.
Questa tecnica è stata introdotta da Marvin Minsky negli anni ‘50 ed è stata successivamente implementata e migliorata con l’avanzamento tecnologico nei laser e nei computer fino a diventare una tecnica chiave nelle scienze della vita.

 

Immagine confocale di tubulina (verde, microtubuli) combinata con immagine SIM di cellule Cos7 marcate con TOM20 (rosso, marcatore mitocondriale), DNA (blu, DAPI), SiR (grigio, actina) (scale bar: 10µm)

 

Come funziona un microscopio confocale?

Un microscopio confocale utilizza tipicamente utilizza delle lenti per focalizzare la luce su uno specifico piano focale all’interno del campione. La luce laser emerge dalla sorgente passando attraverso un pinhole (foro), prima di venire diretto verso il campione. Grazie a questo un fascio di luce circoscritto verranno eccitati soltanto i fluorofori vicini al piano focale. La luce riflessa viene poi diretta al detector, anch’esso protetto da un’apertura a pinhole, passando attraverso una lente semi-trasparente.
Il resto del fascio che proviene da percorsi diversi nel campione e altre profondità viene bloccato, rendendo l’immagine risultante rappresentativa di una specifica profondità del campione e a più alta risoluzione. Questa operazione si chiama sezionamento ottico.

Structured Illumination Microscopy
Che cos’è la microscopia a luce strutturata (SIM)?

La microscopia a luce strutturata è una tecnica che permette di raddoppiare la risoluzione rispetto alla microscopia confocale tradizionale. La microscopia a luce strutturata è una tecnica che permette di raddoppiare la risoluzione rispetto alla microscopia confocale tradizionale. La struttura della luce (pattern) viene cambiata diverse volte per generare immagini multiple e produrre un’immagine finale ricostruita che ha una risoluzione laterale circa il doppio di quella degli strumenti limitati alla diffrazione, cioè vicino a 100-130 nm.

 

Surgical Photonics & Engineering Laboratory, Harvard Medical School, Boston (scale bar: 10µm)

 

Quali sono i vantaggi della SIM?

Il successo della SIM deriva dal fatto che è molto più semplice e veloce rispetto ad altre tecniche di super-risoluzione, come la dSTORM, consentendo di studiare in dettaglio strutture subcellulari o effettuare sequenze temporali di immagini in campioni vivi. La microscopia SIM funziona molto bene con fluorofori convenzionali perciò è possibile acquisire immagini di campioni esistenti senza la necessità di stravolgere i protocolli di marcatura. Per ottenere una risoluzione maggiore del widefield basta utilizzare un microscopio più avanzato senza reinventare la preparativa.
La SIM, inoltre, è molto più veloce della microscopia basata sulla localizzazione, il che la rende più adatta ad applicazioni live in super-risoluzione. Vanno comunque adottati alcuni accorgimenti circa la specifica metodologia del microscopio poiché alcune inducono il campione al bleaching più velocemente di altre a seconda della frequenza con cui i laser illuminano ogni parte del campione.
Il sezionamento ottico (equivalente alla microscopia confocale) e la microscopia SIM sono applicate con maggior facilità su campioni spessi come i tessuti.

 

Prof. D. Jakimowicz lab, the University of Wroclaw, Poland (scale bar: 10µm)

 

Quali sono i limiti della SIM?

Se quello che cercate è una risoluzione molto spinta (da 20 a 50 nm), allora la SIM è superata da altre tecniche come la microscpia dSTORM e PALM. Inoltre, è molto facile incappare in artefatti a causa di una preparazione poco attenta del campione perciò è essenziale informarsi correttamente e adottare gli adeguati accorgimenti prima di ogni esperimento.

La microscopia super-risoluzione
Che cos’è la microscopia STORM?

Inventata nel 2006, la microscopia STORM è diventata oggi la tecnica di microscopia a super-risoluzione più diffusa per l’imaging di singola molecola. L’acronimo STORM sta per “Stochastic Optical Reconstruction Microscopy” e si basa sull’attivazione stocastica di singoli fluorofori con proprietà di foto attivazione.
Durante la STORM, i singoli fluorofori “lampeggiano” mediante un processo di attivazione casuale da uno stato spento, ad uno stato attivo o di emissione, seguito rapidamente da un ritorno allo stato spento, o photobleaching. Questo processo viene ripetuto in sequenza molte volte fino a raccogliere i segnali provenienti dalla maggior parte dei fluorofori. Perché la tecnica sia efficiente, i singoli segnali dei fluorofori devono essere sufficientemente sparsi da far sì che in ogni momento un solo segnale venga attivato nel raggio dettato dal limite di diffrazione.
Durante il processo di ricostruzione dell’immagine, le singole molecole vengono localizzate con precisione determinando le loro coordinate essendo ottenute dai fotoni rilevati ad ogni evento di attivazione (di solito come funzione Gaussiana).

 

Immagine dSTORM di miofibrille di psoas di coniglio marcate con anticorpo T12-AF647 (blu). L’anticorpo si distribuisce in due linee parallele, una da ogni lato del disco Z, distanziate di 160-200 nm. Campioni forniti da Mathias Gautel, Pauline Bennett, e Susan Cox

 

Che cos’è la microscopia PALM?

PALM, acronimo di “Photoactivated Localization Microscopy”, è una tecnica di microscopia a super-risoluzione inventata da Eric Betzig e Harald Hess, il cui lavoro è stato riconosciuto a livello internazionale con l’assegnazione del Premio Nobel per la Chimica nel 2014. Betzig ha condiviso il premio con Stefan Hell e William Moerner per il loro contributo nell’infrangere la barriera del limite della diffrazione nella microscopia a fluorescenza.
La microscopia PALM impiega dei fluorofori foto attivabili per risolvere i dettagli spaziali di molecole fortemente impaccate. Quando vengono eccitati dai laser, i fluorofori emettono fotoni per un breve lasso di tempo per poi andare incontro a bleaching. I laser attivano i fluorofori in modo stocastico finché tutti non hanno emesso fluorescenza. L’attivazione casuale in piccoli gruppi permette di ottenere una visualizzazione più accurata della posizione di ogni segnale, rendendo la microscopia PALM una tecnica chiave tra le microscopie basate sulla localizzazione.
Il segnale di ciascun fluoroforo è comunque soggetto al limite di diffrazione della luce di 300 nm. Tuttavia, poiché ciascun segnale viene attivato separatamente, si può calcolare con elevata accuratezza il centro di massa di ognuno. La localizzazione viene determinata utilizzando la funzione PSF (Point Spread Function) raggiungendo una risoluzione di 20 nm. Combinando assieme i punti definiti con la migliore accuratezza si ottiene un’immagine completa di microscopia a super-risoluzione.
La microscopia PALM può essere accoppiata alla microscopia TIRF o HILO per migliorare il rapporto segnale-rumore dei campioni più sottili. Questo espande le possibilità di imaging per i ricercatori impegnati nello studio di complessi proteici in membrane o di microvescicole.

Single-particle tracking
Che cos’è il single-particle tracking?

Il Single-particle tracking (SPT) è uno strumento molto utile in microscopia che permette di seguire il moto di singole particelle marcate fluorescenti (molecole, vescicole, virioni o altri complessi molecolari) all’interno di un mezzo di coltura o in cellule vive e di ottenere informazioni sul loro comportamento dinamico nel tempo.
I tracciati di ogni singola particella forniscono informazioni utili ai ricercatori al fine di comprendere la posizione, gli spostamenti e le interazioni di molecole in sistemi molto dinamici o che richiedono un’osservazione per periodi prolungati. Dopo l’acquisizione, la posizione delle particelle tracciate viene determinata con una precisione nanometrica mediante algoritmi d’analisi dell’immagine. Mediante nuove tecniche sempre più all’avanguardia, è possibile estrapolare le traiettorie dalle sequenze temporali con una risoluzione sull’ordine dei millisecondi.

 

 

Perché il single-particle tracking è utile?

Il single-particle tracking viene utilizzato per investigare un ampio spettro di processi biologici, incluso il moto di molecole (proteine o DNA) nel citoplasma e nel nucleo, il moto di vescicole o particelle virali nel citoplasma o nel terreno di coltura, il movimento di lipidi e proteine all’interno delle membrane o tra i diversi comparti cellulari o l’internalizzazione di fattori esterni in processi di gene e drug delivery. Mediante questa tecnica è possibile anche indagare le relazioni struttura-funzione di sistemi complessi, generandone mappe di localizzazione 2D o 3D.

Single-molecule FRET
Che cos’è la microscopia FRET a singola molecola (smFRET)?

La smFRET è una tecnica biofisica che permette di misurare distanze tra singole molecole in una scala da 1 a 10 nanometri. FRET è l’acronimo di “Förster Resonance Energy Transfer” e si riferisce al meccanismo di trasferimento di energia tra due cromofori.
Questo fenomeno naturale avviene tra due fluorofori, denominati donatore e accettore, quando si trovano ad una distanza inferiore ai 10 nm. L’energia emessa dal donatore viene trasferita all’accettore, che di conseguenza emetterà fluorescenza anche se non direttamente eccitato. Perché l’esperimento FRET sia efficace, la coppia donatore-accettore dev’essere accuratamente selezionata, in modo che lo spettro di emissione del donatore sia almeno parzialmente sovrapposto a quello di assorbimento dell’accettore.

 

 

Questa tecnica si presta ad innumerevoli esperimenti e applicazioni. È possibile, per esempio, misurare la stechiometria d’interazioni biomolecolari e le distanze intra – e intermolecolari. Inoltre, è possibile studiare la frequenza e la durata degli aventi di binding o interpretare qualitativamente i dati per studiare i cambi conformazionali transienti delle macromolecole.
Brevemente, la smFRET può essere utilizzata per quantificare e caratterizzare:

  • Eventi di binding
  • Dinamiche e transizioni intramolecolari
  • Interazioni specifiche e assemblaggio di complessi
  • Cinetiche e dwell times per singole molecole

Questa tecnica è stata implementata con successo in molti campi, dal folding proteico ai cambi conformazionali degli acidi nucleici, dai meccanismi di fusione delle vescicole al funzionamento dei canali ionici.

 

 

Quali sono i limiti della smFRET?

Il calcolo dell’efficienza di trasferimento di energia risente di molti altri fattori oltre alla distanza tra i fluorofori. Per esempio, è importante tenere conto dell’orientamento reciproco di donatore e accettore, dell’ambiente cellulare in cui si trovano e delle specifiche aree delle macromolecole target a cui sono legati. Tuttavia, un’analisi mediata di popolazione può aiutare a migliorare l’accuratezza e, per raccogliere risultati significativi sui movimenti delle molecole e i dwell times, non è sempre necessario determinare la distanza con assoluta precisione.

 

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