La tecnologia brevettata “Phasefocus Virtual Lens” è un nuovo metodo per generare immagini quantitative ad alto contrasto. È nota nella letteratura scientifica come pticografia e rientra nella categoria di Quantitative Phase Imaging (QPI). Phasefocus sostituisce le lenti tradizionali di un microscopio con una lente virtuale digitale. Quando si illumina un campione con un raggio laser, elettronico o a raggi X, questo viene diffratto dal campione e si formano dei pattern di diffrazione. Phasefocus ha sviluppato una tecnologia digitale per tradurre questi pattern in immagini quantitative: la pticografia o Phasefocus Virtual Lens.
La pticografia funziona sia nelle applicazioni di luce trasmessa che di luce riflessa e, con le sorgenti e i detectors adatti, può operare utilizzando qualsiasi lunghezza d’onda nello spettro elettromagnetico, nonché fasci di elettroni (o altre particelle), raggi X e persino onde sonore.
Le informazioni generate da questa tecnologia innovativa vengono utilizzate per numerose applicazioni, tra cui il live imaging senza marcatura di cellule, la metrologia delle lenti oftalmiche e la microscopia elettronica. La tecnologia è anche incorporata nei microscopi a raggi X per la ricerca più sofisticati.
Il prodotto di punta di Phasefocus, il Livecyte, utilizza questa potente tecnologia di imaging per produrre video ad alto contrasto di cellule vive senza la necessità di marcatori fluorescenti o di illuminazione ad alta potenza. Ciò consente di monitorare anche le cellule vive più sensibili, come le cellule staminali e le cellule tumorali primarie eterogenee, per lunghi periodi di tempo, (fino a diverse settimane).
Il processo di imaging nel dettaglio
- Il campione viene illuminato su un’area ben precisa denominata “sonda”. L’area della sonda è in genere molto più grande della risoluzione desiderata. La sua distribuzione di fase e ampiezza viene calcolata automaticamente e gli effetti deleteri di eventuali non uniformità nell’illuminazione possono quindi essere eliminati. In effetti, muovendo la sonda in modo essenzialmente casuale, la risoluzione spaziale può essere sostanzialmente aumentata.
- La sonda viene spostata su un numero di posizioni note sul campione, sovrapposte approssimativamente. In alternativa, il campione può essere spostato rispetto alla sonda stazionaria.
- In ciascuna posizione, il pattern di diffrazione trasmesso o riflesso viene registrato su un detector array bidimensionale standard (ad es. un CCD).
- Un algoritmo elabora i pattern di diffrazione per creare una coppia di immagini del campione: un’immagine di ampiezza, o di intensità, e un’immagine di fase. L’immagine di ampiezza è simile a quella di un convenzionale microscopio a campo chiaro, ed è una mappa quantitativa della trasmittanza o riflettanza del campione. La funzione di fase del campione invece è una misura quantitativa del ritardo di fase introdotto mentre il fronte d’onda attraversa o viene riflesso dal campione. Questi due tipi di immagini consentono l’analisi di campioni trasparenti, traslucidi, riflettenti e opachi.
- A seconda del campione e della lunghezza d’onda, i dati di fase possono essere utilizzati per misurare lo spessore, l’indice di rifrazione, la costante dielettrica, la topografia di superficie, l’ambiente del campo magnetico locale e altri parametri di interesse. Poiché l’elaborazione dei dati di immagine avviene all’interno di un computer, la messa a fuoco può essere eseguita dopo l’acquisizione e la lente virtuale può rimuovere le tipiche aberrazioni associate ai tradizionali sistemi basati su obiettivi.
Le informazioni quantitative sulla fase possono essere elaborate per fornire la morfologia del campione e la topografia, effettuare imaging cellulare ad elevato contrasto, misurare campioni trasparenti, ad esempio lenti a contatto, e mappare campi elettrici e magnetici, il tutto con informazioni numeriche eccezionalmente precise, nonché immagini molto nitide.
A differenza delle immagini convenzionali ottenute da microscopi a contrasto di fase, i video generati da Livecyte sono ideali per l’analisi delle immagini a valle poiché le cellule appaiono come oggetti luminosi su uno sfondo scuro, simile alle immagini in fluorescenza. Il software di analisi delle immagini integrato consente una segmentazione automatica e robusta, e un monitoraggio continuo di ogni cellula durante il time-lapse. A differenza delle tecniche basate sulle analisi di popolazione, il Livecyte può rivelare i cambiamenti della morfologia, del movimento e della massa secca di ciascuna cellula nel tempo. Ciò porta a una caratterizzazione avanzata delle proprietà fenotipiche delle cellule.
