La piattaforma Leprechaun sfrutta la combinazione tra interferometria e fluorescenza per la completa caratterizzazione di esosomi ed EVs.
Il cuore della tecnologia è costituito da un chip sul quale sono presenti fino a 6 distinte aree con quattro diversi anticorpi per la cattura specifica delle vescicole attraverso i loro marker superficiali. Il chip standard è attualmente basato su anticorpi umani anti-tetraspanine: CD81, CD63 e CD9 ma sono presenti anche kit per anticorpi murini ed è possibile customizzare i sensori con specifici anticorpi.
Il sistema non richiede la purificazione del campione misurando solo EV specifici che presentano antigeni target sulla loro superficie. Utilizzando solo 35 uL di campione diluito, la piattaforma fornisce fenotipo, dimensione e conta direttamente dai fluidi biologici. I contaminanti non si legano per catturare gli anticorpi e sono quindi assenti dal dosaggio. È stato infatti dimostrato come durante la purificazione del plasma mediante ultracentrifugazione, la maggior parte delle particelle rilevabili misurate all’interno di un campione siano risultate essere lipoproteine anziché EV. Leprechaun bypassa questi e altri contaminanti analizzando selettivamente le EVs di un particolare profilo proteico.
Il campione viene esposto a tutti gli anticorpi presenti sul sensore durante la fase di incubazione portando ad una cattura di tutte le sottopopolazioni di EV. Grazie alla cattura diretta sul sensore è possibile ricavare informazioni sulla distribuzione dimensionale e numero di EVs legate a ciascuno spot di anticorpo in un range dimensionale a partire da 50 nm.
Figura 1: Schema di funzionamento di un chip Tetraspanina. Ciascun chip viene incubato con un campione per la cattura delle vescicole mediate da anticorpi specifici contro marker superficiali. Ciascuno spot è in grado di “registrare” fino a 5000 eventi rendendo il sistema statisticamente robusto.
Figura 2: Detection di vescicole extracellulari direttamente da mezzo di coltura cellulare.
Leprechaun è in grado di rappresentare EVs di soli 35 nm di diametro con un’eccellente risoluzione picco-picco in campioni eterogenei. A differenza delle tecniche che si basano sulla diffusione della luce, Leprechaun misura le dimensioni utilizzando una tecnologia proprietaria basata sull’interferometria, SP-IRIS, che migliora la sensibilità di alle piccole particelle.
Figura 3: Distinte sottopopolazioni EV definite dalla dimensione e dall’espressione del marcatore proteico. In un sistema transitorio overespresso di CD171, è stata rilevata una sottopopolazione di vescicole più grandi (80-150 nm) che era negativa per le tetraspanine (CD81, CD63, CD9)
Figura 4: Analisi di particelle NIST mediante tecnica Leprechaun (linea tratteggiata modello NIST, linea continua risultati sperimentali).
Lo step analitico successivo consente la determinazione della co-localizzazione di markers superficiali sulla superficie delle EVs catturate sul chip, ad esempio la porzione di EVs positivi al CD9 che presentano anche CD81. Per questa operazione è necessario marcare le vescicole catturate con anticorpi fluorescenti anti-CD81, anti-CD9 e anti-CD63 e misurarne il singolo segnale di fluorescenza.
Figura 5: Co-localizzazione di biomarkers su singola vescicola. Le vescicole catturate sulla superficie del sensore sono marcate con una miscela di anticorpi fluorescenti anti-CD81, anti-CD63, anti-CD9 per verificare se e quanto sono colocalizzati su singole vescicole.
In questo secondo step risulta possibile riconoscere qualsiasi marker di interesse purché si disponga dello specifico anticorpo opportunamente marcato con un fluoroforo compatibile (Alexa o CF nelle lunghezze d’onda compatibili con il sistema). Esistono inoltre kit per la caratterizzazione del materiale trasportato all’interno dell’esosoma sfruttando lo stesso principio.
Figura 6: Rilevamento specifico del contenuto di Syntenin all’interno di EVs con permeabilizzazione. Le EVs delle cellule WT mostrano poca colorazione di Syntenin. La loro permeabilizzazione porta ad un drammatico aumento della colorazione. La colorazione è specifica, confermata dalla mancanza di colorazione nei Syntenin KO EV permeabilizzati. CD63 funge da controllo positivo.
