Size Exclusion Cromatography (SEC) per le EVs

Principio di funzionamento delle Colonnine SEC e MM

1. Introduzione alla Cromatografia a Esclusione Dimensionale (SEC)

La cromatografia a esclusione dimensionale, o SEC (Size Exclusion Chromatography), è una tecnica cromatografica che separa le molecole in base alla loro dimensione idrodinamica (volume apparente in soluzione) sfruttando un mezzo stazionario poroso.

È particolarmente utilizzata per:

• Isolare vescicole extracellulari (EVs) come esosomi e microvescicole
• Separare proteine, lipoproteine, aggregati
• Purificare nanoparticelle o virus da matrici complesse

2. Meccanismo di separazione – Colonnine SEC

Le colonnine SEC sono riempite con una resina inerte e idrofila composta da polimeri con una rete di pori calibrati. Il principio chiave è il seguente:

Molecola	Interazione con la colonna	Tempo di eluizione
Grande (es. EVs)	Non entra nei pori → percorre percorso più breve	Eluisce per prima
Piccola (es. proteine, sali)	Entra nei pori → subisce ritardo	Eluisce più tardi

Caratteristiche fisiche delle colonnine:

• Volume V₀ (void) = volume al di fuori dei pori → è dove eluiscono le molecole più grandi
• Volume totale Vt = tutto il volume della colonna
• Le molecole vengono separate senza interazioni chimiche, rendendo la SEC particolarmente gentile e non denaturante

3. Applicazione nella Purificazione di EVs

Le vescicole extracellulari, con dimensioni tipiche tra 30–200 nm, sono troppo grandi per entrare nei pori della resina, quindi eluiscono nei primi frazionamenti (frazioni 1–4 tipicamente).

Contaminanti più piccoli (albumina, miRNA liberi, proteine solubili) eluiscono più tardi (frazioni 6–12).

4. Focus Tecnico: Colonnine MM (Mixed Matrix)

Le colonnine MM (Mixed Matrix) rappresentano un avanzamento evolutivo rispetto alla SEC tradizionale, sviluppato specificamente per affrontare le problematiche di contaminazione da lipoproteine nei fluidi biologici, come plasma e siero.

 Caratteristiche:

• Composizione della resina: una miscela ottimizzata di supporti con diversi range di porosità, che consente una separazione più netta tra EVs e lipoproteine.
• Cutoff poroso regolato: rispetto alle classiche 4B (~35 nm), le MM si avvicinano a un cutoff di ~70–100 nm, favorendo l’eluizione anticipata delle EVs ma ritardando le lipoproteine a densità intermedia (IDL, LDL).
• Riduzione significativa delle ApoB+: la componente lipoproteica associata a ApoB, spesso copiosa nel plasma umano, viene drasticamente ridotta nelle frazioni EVs.

5. Il funzionamento step-by-step (SEC/MM)

1. Equilibratura: la colonna viene lavata con tampone (es. PBS) per rimuovere conservanti e stabilizzare la resina.
2. Carico del campione: si applicano 100–500 µL di siero/plasma o surnatante di coltura.
3. Separazione gravitazionale o con pompa: il flusso avviene per gravità o pressione controllata, garantendo tempi stabili.
4. Raccolta frazioni: le frazioni vengono raccolte in volumi tipici da 500 µL. Le frazioni 1–4 contengono le EVs, mentre le frazioni successive contengono proteine e lipoproteine residue.
5. Analisi post-purificazione: le EVs possono essere quantificate (NTA), caratterizzate (Western blot, TEM, ExoView/Leprechaun) o usate per downstream omici (RNAseq, proteomica).

6. Vantaggi delle colonnine MM

Parametro	Colonnine SEC tradizionali	Colonnine MM
Purezza EVs	Buona	Eccellente (alta rimozione lipoproteine)
Recupero EVs	Elevato	Elevato
Specificità per vescicole	Media	Alta (meno contaminanti)
Adatte a siero/plasma	Sì, ma con presenza ApoB	Sì – con riduzione ApoB+ marcata
Compatibilità strumenti	Tutti i sistemi SEC	Sistemi manuali o automatizzati (es. Ascent)

7. Considerazioni Finali

Le colonnine SEC rappresentano una soluzione affidabile e delicata per l’isolamento delle vescicole extracellulari, adatta a numerosi tipi di campioni biologici. L’introduzione della variante MM (Mixed Matrix) consente di ottenere EVs di maggiore purezza, migliorando significativamente la qualità dei dati downstream nei settori clinici e bioanalitici.