Una domanda?
Bisogno di aiuto?

Tecniche

Surface Plasmon Resonance: SPR e diSPR®

Monitorare in tempo reale le interazioni biomolecolari

La tecnica Surface Plasmon Resonance SPR si basa su un fenomeno ottico di nome simile che consente l’osservazione in tempo reale d’interazioni di legame fra un analita in soluzione ed un ligando immobilizzato su un biosensore. In SPR, il sensore è costituito da un substrato di vetro (prisma) ricoperto da un film semi-trasparente d’oro, esso ricoperto da un polimero funzionalizzato. I sensori SPR reagiscono a cambiamenti di indice di rifrazione alla loro superficie, cambiamenti direttamente proporzionali alla massa legata al biosensore.
Negli strumenti SPR più accurati, la superficie biosensibile costituisce il fondo di una cella a flusso di decine di nanolitri! Un sistema di microfluidica mantiene un costante flusso di tampone al contatto della superficie biosensibile e consente di veicolare i campioni fino alla superficie del biosensore. Quando la massa si accumula sul sensore, ad. esempio durante l’interazione di legame tra biomolecole, l’indice di rifrazione cresce alla superficie del sensore e di conseguenza si osserva un aumento della risposta del sensore, espressa in unità di risonanza (RU).
Un unità di risposta SPR (1RU) corrisponde a 10-6 unità d’indice di rifrazione e ca. 1 pg/mm2 di biomolecola. Durante la fase di dissociazione, quando il campione viene sostituito dal buffer nella cella a flusso, la massa decresce con una conseguente diminuzione della risposta in RU. Dalle cinetiche di associazione e dissociazione a diverse concentrazioni di analita, si possono calcolare le costanti di associazione ka (on-rate) e dissociazione kd (off-rate) dell’interazione con il ligando immobilizzato, la costante di affinità KD e la stechiometria del legame.

I vantaggi della tecnica SPR per lo studio delle Interazioni biomolecolari sono numerosi:

  • L’analisi si fa in tempo reale
  • La tecnica SPR non richiede l’uso di campioni con fluorofori o tag
  • La sensibilità della SPR consente di studiare l’interazione di macromolecole con piccole molecole
  • La SPR consente di determinare le costanti cinetiche e di affinità, anche per interazioni deboli
  • La SPR fornisce anche informazioni stechiometriche e termodinamiche
Dynamic Injection SPR - diSPR®: iniezione a gradiente continuo

La diSPR® è un pacchetto di metodologie d'iniezioni d'ultima generazione disponibile esclusivamente sugli strumenti Pioneer della Pall ForteBio. Al centro della tecnica diSPR® ci sono le 2 metolologie d'iniezione OneStep™ e NeXtStep™.

Nelle iniezioni OneStep™ viene sfruttato il fenomeno della dispersione di Taylor per generare un gradiente di concentrazione continuo dell'analita ed ottenere una risposta di dosaggio ad alta risoluzione in una singola iniezione. Le iniezioni OneStep™  forniscono una maggiore caratterizzazione biofisica e una maggiore produttività rispetto all'approccio convenzionale (iniezioni successive di varie concentrazioni d'analita). Una titolazione completa con l'analita su 3-4 ordini di grandezza di concentrazione è registrata in pochi minuti. Il gradiente generato si conforma alla dispersione di Taylor e consente quindi una modellizzazione accurata della concentrazione durante l'iniezione per un trattamento dei dati SPR accurato ed affidabile.La tecnica fornisce anche un metodo per la determinazione del coefficiente di diffusione dell'analita che può essere utilizzato per valutare se l'analita è eterogeneo o aggregato, informazioni preziose nelle analisi biofisiche.

L'iniezione OneStep™ è stata descritta nel 2012 ed introdotta con il nome TDi (Taylor Dispersion Injection) per poi essere rinominata OneStep™.

Screening di frammenti o piccole molecole con diSPR®

Lo screening di frammenti implica di gestire un gran numero di campioni, analiti a basso peso molecolare (< 300 Da) ed interazioni ad affinità deboli (KD: 10 uM a 10 mM) che costituiscono una serie di sfide dal punto di vista tecnico. Basso peso molecolare, affinità debole e solubilità limitata impediscono di testare il legame a concentrazioni superiori alla KD e spesso si traducono in decisioni basate su curve di risposta SPR quadrate e di bassa intensità di segnale. OneStep® può migliorare notevolmente lo screening di frammenti e piccole molecole aumentando la produttività (through-put) e il contenuto dei dati grazie ai gradienti continui di concentrazione, e diminuendo i tempi legati alla preparazione dei campioni.

OneStep® elimina l'esigenza di gestire varie diluizioni generando un gradiente continuo di concentrazione utilizzando un'unica concentrazione del campione e il tampone di corsa. Il software di analisi dati del Pioneer (Qdat) prevede i modelli di fitting cinetici e steady-state (all'equilibrio), con correzioni per la limitazione di trasporto di massa, e per le interazioni multi-sito. La determinazione delle affinità KD è pertanto resa possibile già dai dati di screening primari senza la necessità di un laborioso screening secondario e la preparazione di campioni aggiuntivi. 

Le applicazioni della SPR

Le applicazioni della tecnica SPR sono numerose, nel campo farmaceutico, diagnostico, genetico, nano tecnologico.


La Surface Plasmon Resonance fornisce informazioni di grande valore per tutti quelli che lavorano sul drug discovery, la regolazione dei geni o più generalmente sugli studi di struttura/funzione di biomolecole, ad esempio per:

  • caratterizzare la cinetica, l’affinità e la stechiometria di un’interazione,
  • determinare la concentrazione di un componente in una miscela,
  • realizzare studi termodinamici,
  • studiare l’effetto del mezzo su un’interazione (pH, sali, additivi, etc.),
  • effettuare screening e selezione di anticorpi, screening di supernatanti di ibridomi
  • il fishing di ligando sconosciuto,
  • il mapping di epitopi, etc.

Le interazioni comunemente studiate includono:

  • Proteina - proteina
  • Proteina - D.N.A
  • Proteina - Piccole Molecole < 100Da
  • Anticorpo - Antigene
  • Recettore di Membrana-Ligando
  • Peptide - Recettore
Risonanza Plasmonica di Superficie

In SPR, il sensore è costituito da un substrato di vetro (prisma) ricoperto da un film semi-trasparente d’oro.
Quando il prisma viene illuminato, la luce passa attraverso il vetro ed è riflessa dal rivestimento . Ad un angolo superiore al angolo critico θc (n1>n2), osserviamo una totale riflessione della luce (Total internal reflection).

Ad un certo angolo d’incidenza θi>θc, una porzione dell’energia luminosa si accoppia attraverso il rivestimento in oro, formando quella che si ridefinisce una “Plasmon Resonance Wave” che si propaga lungo la superficie.

Se si usa una luce incidente monocromatica (laser), un minimo nel intensità riflessa in funzione del angolo d’incidenza θi è osservato al angolo θSP. L’angolo di luce incidente necessario a mantenere la Surface Plasmon Wave (θSP) è estremamente sensibile alle variazioni dell’indice di rifrazione alla superficie del sensore. Questa proprietà viene utilizzata per monitorare in tempo reale i cambiamenti d’indice di rifrazione dovuti ai fenomeni di associazione e dissociazione alla superficie del sensore.

La luce emessa da un LED passa attraverso un polarizzatore e poi viene riflessa dalla superficie in oro. Successivamente un array detector (PDA) rileva la luce riflessa e di conseguenza, una caduta del segnale in corrispondenza dell’angolo di accoppiamento della luce con la superficie in oro θSP (dove si forma la Superficie Plasmon Wave).

Prodotti correlati