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Tecniche

Surface Plasmon Resonance(SPR)

Monitorare in tempo reale le interazioni biomolecolari

La tecnica Surface Plasmon Resonance SPR si basa su un fenomeno ottico di nome simile che consente l’osservazione in tempo reale d’interazioni di legame fra un analita in soluzione ed un ligando immobilizzato su un biosensore. In SPR, il sensore è costituito da un substrato di vetro (prisma) ricoperto da un film semi-trasparente d’oro, esso ricoperto da un polimero funzionalizzato. I sensori SPR reagiscono a cambiamenti di indice di rifrazione alla loro superficie, cambiamenti direttamente proporzionali alla massa legata al biosensore.
Negli strumenti SPR più accurati, la superficie biosensibile costituisce il fondo di una cella a flusso di decine di nanolitri! Un sistema di microfluidica mantiene un costante flusso di tampone al contatto della superficie biosensibile e consente di veicolare i campioni fino alla superficie del biosensore. Quando la massa si accumula sul sensore, ad. esempio durante l’interazione di legame tra biomolecole, l’indice di rifrazione cresce alla superficie del sensore e di conseguenza si osserva un aumento della risposta del sensore, espressa in unità di risonanza (RU).
Un unità di risposta SPR (1RU) corrisponde a 10-6 unità d’indice di rifrazione e ca. 1 pg/mm2 di biomolecola. Durante la fase di dissociazione, quando il campione viene sostituito dal buffer nella cella a flusso, la massa decresce con una conseguente diminuzione della risposta in RU. Dalle cinetiche di associazione e dissociazione a diverse concentrazioni di analita, si possono calcolare le costanti di associazione ka (on-rate) e dissociazione kd (off-rate) dell’interazione con il ligando immobilizzato, la costante di affinità KD e la stechiometria del legame.

I vantaggi della tecnica SPR per lo studio delle Interazioni biomolecolari sono numerosi:

  • L’analisi si fa in tempo reale
  • La tecnica SPR non richiede l’uso di campioni con fluorofori o tag
  • La sensibilità della SPR consente di studiare l’interazione di macromolecole con piccole molecole
  • La SPR consente di determinare le costanti cinetiche e di affinità, anche per interazioni deboli
  • La SPR fornisce anche informazioni stechiometriche e termodinamiche

OneStep® elimina l'esigenza di gestire varie diluizioni generando un gradiente continuo di concentrazione utilizzando un'unica concentrazione del campione e il tampone di corsa. Il software di analisi dati del Pioneer (Qdat) prevede i modelli di fitting cinetici e steady-state (all'equilibrio), con correzioni per la limitazione di trasporto di massa, e per le interazioni multi-sito. La determinazione delle affinità KD è pertanto resa possibile già dai dati di screening primari senza la necessità di un laborioso screening secondario e la preparazione di campioni aggiuntivi. 

Le applicazioni della SPR

Le applicazioni della tecnica SPR sono numerose, nel campo farmaceutico, diagnostico, genetico, nano tecnologico.


La Surface Plasmon Resonance fornisce informazioni di grande valore per tutti quelli che lavorano sul drug discovery, la regolazione dei geni o più generalmente sugli studi di struttura/funzione di biomolecole, ad esempio per:

  • caratterizzare la cinetica, l’affinità e la stechiometria di un’interazione,
  • determinare la concentrazione di un componente in una miscela,
  • realizzare studi termodinamici,
  • studiare l’effetto del mezzo su un’interazione (pH, sali, additivi, etc.),
  • effettuare screening e selezione di anticorpi, screening di supernatanti di ibridomi
  • il fishing di ligando sconosciuto,
  • il mapping di epitopi, etc.

Le interazioni comunemente studiate includono:

  • Proteina - proteina
  • Proteina - D.N.A
  • Proteina - Piccole Molecole < 100Da
  • Anticorpo - Antigene
  • Recettore di Membrana-Ligando
  • Peptide - Recettore
Risonanza Plasmonica di Superficie

In SPR, il sensore è costituito da un substrato di vetro (prisma) ricoperto da un film semi-trasparente d’oro.
Quando il prisma viene illuminato, la luce passa attraverso il vetro ed è riflessa dal rivestimento . Ad un angolo superiore al angolo critico θc (n1>n2), osserviamo una totale riflessione della luce (Total internal reflection).

Ad un certo angolo d’incidenza θi>θc, una porzione dell’energia luminosa si accoppia attraverso il rivestimento in oro, formando quella che si ridefinisce una “Plasmon Resonance Wave” che si propaga lungo la superficie.

Se si usa una luce incidente monocromatica (laser), un minimo nel intensità riflessa in funzione del angolo d’incidenza θi è osservato al angolo θSP. L’angolo di luce incidente necessario a mantenere la Surface Plasmon Wave (θSP) è estremamente sensibile alle variazioni dell’indice di rifrazione alla superficie del sensore. Questa proprietà viene utilizzata per monitorare in tempo reale i cambiamenti d’indice di rifrazione dovuti ai fenomeni di associazione e dissociazione alla superficie del sensore.

La luce emessa da un LED passa attraverso un polarizzatore e poi viene riflessa dalla superficie in oro. Successivamente un array detector (PDA) rileva la luce riflessa e di conseguenza, una caduta del segnale in corrispondenza dell’angolo di accoppiamento della luce con la superficie in oro θSP (dove si forma la Superficie Plasmon Wave).

Interferometria in guida d'onda - Waveguide Interferometry

Come la risonanza plasmonica di superficie, anche l'interferometria a guida d'onda misura i cambiamenti nell'indice di rifrazione sulla superficie del sensore. Tuttavia, a differenza della risonanza plasmonica di superficie tradizionale, la luce nell'interferometria in guida d'onda può viaggiare attraverso l'intera lunghezza del campione. Ciò consente a più eventi di contribuire al segnale complessivo, conferendo una sensibilità primaria intrinsecamente più elevata per l'analisi dell'interazione label-free, specialmente se abbinata a una lettura interferometrica per tradurre il cambiamento di fase in un modello di intensità. Un ulteriore vantaggio dell'interferometria in guida d'onda rispetto alla risonanza plasmonica di superficie è che il campo evanescente penetra meno in profondità nel campione, riducendo al minimo il disturbo causato dalle variazioni dell'indice di rifrazione di massa e aumentando il rapporto segnale-rumore. Leggi di più, clicca qui