Misura assoluta e label-free di size e stabilità di biomolecole in matrici complesse
La Taylor Dispersion Analysis è una tecnica a flusso microcapillare che permette l’analisi dimensionale di piccole molecole, peptidi, proteine e loro miscele in soluzione. La TDA misura l’evoluzione nel tempo del profilo di concentrazione (Taylorgramma) di un piccolissimo plug di campione (nanolitri) iniettato in un flusso laminare di un opportuno buffer. Dall’analisi del Taylogramma si determina il coefficiente di diffusione e, quindi, si calcola il raggio idrodinamico delle molecole in soluzione.
Un detector UV rileva le molecole target in due posizioni fisse lungo il microcapillare. La misura viene ottimizzata selezionando differenti lunghezze d’onda per migliorare sensibilità e selettività. La possibilità di normalizzare la linea di base rispetto ad un buffer complesso consente la caratterizzazione label-free di size e stabilità di biomolecole in soluzione anche in presenza di miscele complesse. In effetti, la tecnica TDA consente di rendere invisibili eccipienti e surfattanti rispetto all’analita di interesse.
Principio di misura
Il principio di misura si basa sul seguente processo analitico:
- Un piccolo “plug” di campione di qualche nanolitro è iniettato a t0 in un flusso laminare di un buffer opportuno all’interno di un microcapillare
- Il plug di campione si disperde durante il percorso nel microcapillare in seguito a dispersione (direzione assiale) e diffusione (direzione radiale)
- Un detector UV posizionato in 2 precise finestre di misura lungo il microcapillare analizza l’assorbanza del campione da t1 a tn.
- L’assorbanza è plottata in funzione del tempo per generare un profilo di concentrazione detto Taylorgramma
- L’ampiezza del Taylorgramma è proporzionale al coefficiente di diffusione molecolare (D) dell’analita in soluzione e permette il calcolo del raggio idrodinamico (Rh)
La tecnica consente di rilevare differenti popolazioni in matrici complesse o miscele (monomeri ed oligomeri ad esempio) grazie all’utilizzo del detector UV che fornisce un segnale ponderato in massa. L’abilità di monitorare il contributo di una molecola utilizzando una proprietà indipendente dalla dimensione offre numerosi vantaggi sia nella caratterizzazione di campioni complessi in fase di sviluppo della formulazione, sia per studi di stabilità di campioni con aggregati, ad alte concentrazioni di eccipienti o in mezzi biologici complessi.
