Monitoraggio a lungo termine, non invasivo della vitalità di cellule trattate con paclitaxel
La vitalità cellulare è di grande interesse per molti ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci, della ricerca sul cancro e della medicina rigenerativa. Al giorno d’oggi, una parte sempre più consistente della ricerca si concentra sugli effetti a lungo termine di un determinato composto sulla vitalità cellulare. I metodi comunemente usati per determinare la vitalità cellulare sono conteggio delle cellule, colorazione per la vitalità/morte cellulare e test dell’attività metabolica.
- Il conteggio delle cellule tramite metodi di esclusione di coloranti (come la tecnica di esclusione del blu tripano) è semplice e veloce, ma richiede che le cellule si trovino in una sola sospensione cellulare prima di conteggiarle con un emocitometro o un contatore di cellule automatico [1]. Questa tecnica invasiva rende il conteggio cellulare inadeguato per il monitoraggio della vitalità sul lungo termine. Un’opzione per consentire il monitoraggio della vitalità a lungo termine usando il conteggio cellulare sarebbe quella di ripetere i conteggi delle cellule con diversi campioni in diversi momenti, cosa che richiede elevate quantità di cellule, materiale usa e getta e reagenti. Inoltre, questo metodo spesso richiede molto tempo ed è faticoso, dal momento che i campioni devono essere conteggiati uno alla volta.
- La colorazione per la vitalità/morte cellulare consiste di un colorante che colora specificatamente le cellule vive insieme a un altro colorante che colora quelle morte [1]. Il rapporto tra cellule vive e morte può essere determinato in modo semplice conteggiando le cellule manualmente o usando un software di analisi dell’immagine. Questo metodo offre un calcolo molto preciso del rapporto cellule vive/morte, ma può richiedere anch’esso molto tempo quando si analizza un gran numero di campioni. Inoltre, alcuni dei coloranti utilizzati possono essere tossici in caso di tempi di incubazione prolungati. Un problema che si può manifestare in caso di monitoraggio della vitalità sul lungo termine è la scomparsa progressiva del colorante col passare del tempo, dovuta a divisione cellulare durante l’esperimento.
- I noti test MTT [2] e con resazurina (Alamar Blue [3]) sfruttano l’attività metabolica come misura della vitalità cellulare [4]. Un composto di un determinato colore viene trasformato enzimaticamente in un composto (fluorescente) di un altro colore da cellule metabolicamente attive. La quantità di assorbanza/fluorescenza del composto trasformato può quindi essere utilizzata come misura della vitalità cellulare. Il vantaggio dei test dell’attività metabolica rispetto al conteggio cellulare e alla colorazione per la vitalità/morte cellulare è che possono essere facilmente analizzati contemporaneamente più campioni usando un lettore di piastre. Tuttavia, non sono adatti al monitoraggio della vitalità sul lungo termine, dal momento che la maggior parte dei reagenti è tossica [4]. L’unica possibilità per misurare le vitalità in diversi momenti è usare più campioni, e questo richiede un numero elevato di cellule, materiali usa e getta e reagenti. Inoltre, si potrebbe ottenere un plateau in termini di assorbanza/fluorescenza nel caso in cui il composto fosse completamente trasformato.
Un’alternativa non invasiva a questi metodi sarebbe usare la confluenza come misura della vitalità. Elaborando immagini a microscopio di cellule coltivate in diversi momenti, la vitalità può essere monitorata nel corso del tempo senza bisogno di reagenti tossici o campioni destinati ad andare perduti, riducendo così la quantità di campioni necessari. Quando si utilizza il CytoSMART® Omni, un imager automatico di cellule vive, possono essere analizzati contemporaneamente più campioni all’interno di un normale incubatore a CO2. Questo permette l’analisi automatica della confluenza (tramite il software CytoSMART® basato sul cloud) a intervalli predefiniti e in condizioni di coltura ottimali.
Lo scopo del presente studio era eseguire uno studio sulla vitalità cellulare a lungo termine usando le misurazioni della confluenza ottenute col CytoSMART® Omni.
Materiale e metodi
In un vassoio da 96 pozzetti sono state seminate cellule C6 (cellule tumorali gliali murine) a una densità di 21,875 cellule/cm2 in Advanced DMEM (Invitrogeno) con aggiunta del 10% di FBS (Gibco) e dell’1% penicillina-streptomicina (Gibco). Dopo 24 h di coltura (37°C e 5% CO2), lo stabilizzatore dei microtubuli Paclitaxel (PX; Invitrogeno) è stato aggiunto alle cellule in concentrazioni variabili da 1,7 nM a 100 μM (diluizione seriale 1:3). Il vassoio a pozzetti è stato collocato sul CytoSMART® Omni (a 37°C e 5% CO2) per effettuare una scansione all’ora ad alta risoluzione per 70 h dopo l’aggiunta di PX (n = 8 per gruppo). E’ stato utilizzato il software di analisi dell’immagine CytoSMART® per stabilire la confluenza di ogni singolo pozzetto in ogni momento di tempo. I dati di confluenza relativi ad ogni momento di tempo sono stati scaricati dal cloud CytoSMART® e normalizzati per la confluenza dello stesso pozzetto a 0 h, per calcolare la differenza di confluenza a t = 0 h. Le differenze di confluenza normalizzata tra i gruppi sono state analizzate con SPSS Statistics (IBM) utilizzando ANOVA a una variabile, seguita da un test Bonferroni post-hoc a t = 6, 12, 24, 36, 48, 60 e 70 e sono state considerate significative con p < 0,05.
Risultati
Subito dopo l’aggiunta di 100 μM PX le cellule iniziano a staccarsi e aggregarsi (Fig. 1A), senza essere in grado di riattaccarsi durante l’esperimento, portando a una confluenza approssimativamente costante tra 36 e 70 ore (Fig. 2 e 3). Dopo 48 ore la confluenza normalizzata dei campioni trattati con 100 μM PX era decisamente inferiore rispetto alla confluenza normalizzata di tutti gli altri gruppi, eccetto il gruppo trattato con 33 μM PX (Tabella 1).
Quando sono stati aggiunti da 0,4 a 33 μM PX ai campioni, le cellule hanno perso la loro morfologia allungata e si sono staccate (Fig. 1B), con un grado sempre maggiore di distacco all’aumento delle concentrazioni di PX. Contrariamente alle cellule trattate con 100 μM PX, quelle trattate con una quantità compresa tra 0,4 e 33 μM PX sembrano essere in grado di riattaccarsi o proliferare, come dimostrato dall’aumento della confluenza nel corso del tempo (Fig. 2 e 3). La confluenza normalizzata di questi gruppi era decisamente inferiore rispetto ai campioni non trattati in ogni momento e ai campioni trattati con 1,7 nM PX a 48, 60 e 70 h (Tabella 1).
La maggioranza delle cellule trattate con le concentrazioni di PX inferiori (da 1,7 a 137 nM) mantiene la sua forma allungata, mentre solo poche cellule apparivano perfettamente rotonde (Fig. 1C). Tuttavia, a queste concentrazioni di PX, le cellule sembrano non essere in grado di proliferare al tasso delle cellule non trattate, come mostrato dai livelli di confluenza inferiori delle Fig. 2 e 3. Solo negli ultimi momenti di tempo sono state rilevate alcune differenze significative tra i campioni trattati alle concentrazioni inferiori di PX (Tabella 1).
Figura 1. Immagini rappresentative della morfologia della cellula, 24 ore dopo l’aggiunta di paclitaxel. Si mostrano quattro delle 12 concentrazioni: 100 μM (A), 3,7 μM (B), 45,7 nM (C) e 0 nM (D).
Le cellule non trattate hanno forma allungata (Fig. 1D) e proliferano a velocità costante, raggiungendo una confluenza del 100% dopo circa 42 ore dall’inizio dell’esperimento (Fig. 2 e 3).
Figura 2. Cattura dello schermo dei dati di confluenza nel cloud CytoSMART® . La confluenza di ogni gruppo viene mostrata sulla sinistra (media ± deviazione standard). La distribuzione del vassoio, compresi i colori per ogni gruppo, viene mostrata sulla destra.
Figura 3. Confluenza normalizzata delle cellule C6 trattate con 12 diverse concentrazioni di Paclitaxel (media ± deviazione standard; n=12).
La confluenza normalizzata dei campioni non trattati era decisamente superiore rispetto ai campioni trattati con PX in tutti i momenti di tempo oggetto di verifica (Tabella 1).
Tabella 1. Confluenza normalizzata (media ± deviazione standard) a 6, 12, 24, 36, 48, 60 e 70 h dall’aggiunta di PX. *: notevolmente superiore a tutti i gruppi trattati con PX nello stesso momento di tempo. #: decisamente superiore a 100 μM PX nello stesso momento di tempo. $: decisamente inferiore a 1,7 nM PX nello stesso momento di tempo, †: decisamente inferiore a 5,1 nM PX nello stesso momento di tempo, ‡: decisamente inferiore a 15,2 nM PX nello stesso momento di tempo.
Discussione
La vitalità cellulare è in genere stabilita tramite conteggio cellulare, colorazione per la vitalità/morte cellulare o test dell’attività metabolica. Tuttavia, lo svantaggio comune a questi metodi è che di solito sono invasivi, quindi non possono essere utilizzati per il monitoraggio della vitalità sul lungo termine. Un’alternativa non invasiva a questi metodi sarebbe usare la confluenza come misura della vitalità. Pertanto, abbiamo cercato di analizzare uno studio sulla vitalità a lungo termine che utilizzava le misurazioni della confluenza ottenuto con il CytoSMART® Omni.
Nel presente studio, abbiamo dimostrato che la vitalità cellulare di cellule C6 trattate con PX potrebbero essere facilmente stabilite da immagini ottenute ad ogni ora con il CytoSMART® Omni. In qualsiasi momento, la confluenza normalizzata dei campioni non trattati è risultata decisamente superiore rispetto a quella dei campioni trattati con PX. Dal momento che il PX è uno stabilizzatore dei microtubuli genera difetti nella formazione di fusi mitotici, inibendo così la segregazione dei cromosomi e, successivamente, la divisione cellulare [5]. Questo meccanismo d’azione spiega la confluenza (normalizzata) inferiore di tutti i gruppi trattati con PX rispetto al gruppo non trattato, in ogni momento di tempo.
Loubani et al. hanno dichiarato che il PX riduceva l’adesione cellula-cellula tramite la scissione della β- e della γ-catenina [6], proteine necessarie per l’accoppiamento delle cellule sulle giunzioni aderenti. Inoltre, Ling et al. hanno mostrato una ridotta espressione di α5-, αL- e β7- integrine [7], proteine coinvolte nell’adesione cellula-matrice. Questi studi riflettono la ridotta adesione osservata nei campioni trattati con una quantità da 0,4 a 100 μM PX di cui al presente studio.
L’uso di imaging in tempo reale di cellule vive per monitorare la vitalità cellulare non solo fornisce dati quantitativi sulla confluenza, ma anche informazioni qualitative sulla morfologia cellulare. Le variazioni morfologiche forniscono informazioni extra sugli effetti di un determinato composto sulle cellule, informazioni che mancano quando si analizza la vitalità cellulare tramite test dell’attività metabolica o conteggio cellulare. Nel nostro caso, per esempio, il PX non influenza solo la vitalità, ma anche l’adesione cellulare.
L’adesione cellulare maggiormente ostacolata non verrebbe neppure notata analizzando solo l’attività metabolica. Utilizzando il conteggio delle cellule per analizzare la vitalità, le cellule devono essere separate dal loro substrato, eliminando così la possibilità di individuare eventuali modifiche morfologiche causate dal composto oggetto del test. Utilizzando la colorazione per la vitalità/morte cellulare si potrebbero monitorare nel tempo i cambiamenti morfologici, ma può essere visualizzato solo un campione alla volta, cosa che comporta esperimenti molto lunghi. Utilizzando il CytoSMART® Omni, che scansiona automaticamente l’intero vassoio a pozzetti, questo non è più un problema. Inoltre, quando si effettua la scansione delle cellule utilizzando un microscopio convenzionale dotato di un incubatore cellulare, è difficile controllare i livelli di temperatura e CO2. Le condizioni di coltura non ottimali potrebbero incidere sulla vitalità e la morfologia cellulare, e quindi alterare i risultati degli esperimenti. Utilizzare un dispositivo di imaging, come il CytoSMART® Omni, all’interno di un incubatore cellulare, potrebbe essere la scelta giusta rispetto a microscopi dotati di camera di incubazione, dal momento che, nel primo caso, le condizioni di coltura sono ottimali.
Conclusione
Riassumendo, nel presente studio abbiamo dimostrato che il trattamento con Paclitaxel a lungo termine non incide solo sulla vitalità cellulare, ma anche sulla morfologia cellulare. Se aumentano le concentrazioni di Paclitaxel, le alterazioni morfologiche aumentano e il livello di confluenza si riduce. Inoltre, le misurazioni non invasive della confluenza hanno permesso di effettuare il monitoraggio della vitalità cellulare a lungo termine in tempo reale. L’uso di CytoSMART® Omni ha anche garantito il vantaggio di effettuare la coltura cellulare alle condizioni di coltura ottimali, monitorando i cambiamenti in termini di confluenza e morfologia.
References
[1] M. J. Stoddart, “Mammalian Cell Viability,” vol. 740, pp. 1–6, 2011.
[2] T. Mosmann, “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays,” J. Immunol. Methods, vol. 65, no. 1–2, pp. 55–63, 1983.
[3] S. Ansar Ahmed, R. M. Gogal, and J. E. Walsh, “A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay,” J. Immunol. Methods, vol. 170, no. 2, pp. 211–224, 1994.
[4] T. L. Riss et al., “Cell Viability Assays,” in Assay Guidance Manual [Internet], vol. 114, no. 8, K. Sittampalam, G. S.; Coussens, N.P.; Brimacombe, Ed. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2013, pp. 785–796.
[5] B. A. Weaver, “How Taxol/paclitaxel kills cancer cells,” Mol. Biol. Cell, vol. 25, no. 18, pp. 2677–2681, 2014.
[6] O. Loubani and D. W. Hoskin, “Paclitaxel Inhibits Natural Killer Cell Binding to Target Cells by Down-Regulating Adhesion Molecule Expression,” vol. 742, pp. 735–741, 2005.
[7] Y. Ling, Y. Zhong, and R. Perez-Soler, “Disruption of cell adhesion and caspase-mediated proteolysis of beta- and gamma-catenins and APC protein in paclitaxel-induced apoptosis.,” Mol. Pharmacol., vol. 59, no. 3, pp. 593–603, 2001.
