Quale detector light scattering per quale applicazione?

Light scattering è un termine che può creare confusione. Numerose tecniche si basano sul ‘light scattering’ e numerosi parametri diversi possono essere misurati. Alcuni strumenti usano più di una tecnica di light scattering e questo può far perdere di vista i parametri o fattori più importanti da considerare per scegliere la tecnologia light scattering più adatta alle proprie applicazioni.

La ‘static light scattering’, anche chiamata light scattering classica, è una tecnica per misurare il peso molecolare di macromolecole sfruttando la relazione tra l’intensità della luce scatterata dalla molecola ed il suo peso molecolare e/o dimensione. Questa relazione è descritta dalla teoria di Rayleigh che stabilisce che il peso molecolare di una molecola è proporzionale al rapporto di Rayleigh della luce scatterata, cioè il rapporto dell’intensità della luce scatterata e l’intensità della luce incidente.

Tutti gli strumenti basati sulla ‘static light scattering’ rivelano la quantità di luce scatterata dal campione per misurare il suo peso molecolare. All’aumentare della dimensione delle molecole però un secondo fattore chiamato dipendenza angolare diventa significativo. Quando la molecola è piccola rispetto alla lunghezza d’onda del laser nel vuoto λ₀, come nello schema qui sotto, agisce come un punto di scattering e la luce viene scatterata allo stesso modo in tutte le direzioni. Sono molecole scatteranti in modo isotropico.

Quando le molecole aumentano di dimensioni rispetto a λ₀, la dimensione e la struttura cominciano a diventare importanti. Ciascun fotone che proviene dal laser, viene scatterato da punti diversi della molecola. Ciò dipende dal raggio di girazione Rg. I fotoni scatterati variano in fase e quindi interferiscono fra loro: la risultante intensità misurata dipenderà dalla posizione di osservazione. Queste molecole producono scattering anisotropo. Alle dimensioni che ci interessano, tutte le interferenze sono distruttive: ciò significa che l’intensità risulterà sempre inferiore ad uno scattering isotropico. Se utilizzassimo questa intensità per calcolare il peso molecolare, utilizzando l’equazione di Rayleigh, sarebbe sottostimato.

La dipendenza angolare influenza l’intensità della luce scatterata e quindi il peso molecolare calcolato. Occorre dunque tenerne conto.

• Un detector RALS (Right angle light scattering) raccoglie la luce scatterata a 90°. Può misurare il peso molecolare con elevata sensibilità per campioni che scatterano la luce isotropicamente cioè ugualmente in tutte le direzioni, ma non può misurare il peso molecolare quando lo scattering è anisotropico cioè dipendente dall’angolo (molecole più grandi);

Fig. 1A: Schema di un detector RALS schematizzando il flusso attraverso la cella. La luce entra nella cella e viene rilevata a 90°.
Fig. 1B: Con un detector RALS il Debye Plot è ridotto ad un singolo punto che si presume uguale ad ogni angolo e quindi uguale a 1/Mw.

• Un detector LALS (low angle light scattering) raccoglie lo scattering a 7°. Può misurare il peso molecolare di tutte le molecole (dimensione minore e maggiore della lunghezza d’onda dell’asse) ma ha un basso rapporto segnale/rumore;

Fig. 2A: Schema di un detector LALS mostrando il flusso attraverso la cella. La luce entra nella cella e viene rilevata attraverso la stessa finestra ad angolo basso, ad esempio 7°.
Fig. 2B: Con un detector LALS il Debye Plot è ridotto ad un singolo punto molto vicino all’asso Y e quindi uguale a 1/Mw per tutte le molecole.

• Combinando RALS e LALS in un sistema ibrido, si può misurare il peso molecolare di tutti i campioni, massimizzando quando necessario il rapporto segnale/rumore. Un detector RALS/LALS Sfrutta quindi i punti di forza di ambedue senza i loro punti deboli;

Fig. 3A: Schema di un detector ibrido RALS/LALS mostrando il flusso attraverso la cella. La luce entra nella cella e viene rilevata a 90° ed attraverso la stessa finestra ad angolo basso, ad esempio 7°.
Fig. 3B: Con un detector ibrido RALS/LALS il Debye Plot è ridotto a due punti dove il RALS viene usato per massimizzare la sensibilità per campioni a scattering isotropico, mentre il valore LALS viene usato per il calcolo più accurato del Mw per campioni a scattering anisotropico.

• Un rivelatore MALS (Multi Angle Light Scattering) raccoglie lo scattering a vari angoli. Questi dati vengono utilizzati per creare un modello di dipendenza angolare di cui tener conto nel calcolo del peso molecolare. Consente la misura sia nel caso di scattering isotropico che anisotropo, e misura anche il raggio di girazione;

Fig. 4A: Schema di un detector MALS mostrando il flusso attraverso la cella. La luce entra nella cella e la luce scatterata esce a diversi angoli. Viene rilevata dai diversi detectors.
Fig. 4B: Con un detector MALS il Debye Plot è completo e viene estrapolato a 0°. Il peso molecolare Mw è calcolato dall’intercetto e il raggio di girazione Rg è calcolato dalla pendenza iniziale della curva.

• Tutti gli strumenti basati sulla ‘static light scattering’ per correlare l’intensità del segnale di un foto-detector (i.e. l’intensità della luce scatterata) al peso molecolare della molecola responsabile dello scattering, devono essere calibrati. La calibrazione si può effettuare sia utilizzando degli standard di peso molecolare che degli standard di scattering; ciascuno dei due presenta vantaggi e svantaggi descritti nella “sezione calibrazione”, della nota applicativa scaricabile in fondo alla pagina.

Quale detector light scattering per quale applicazione?

Ci sono 4 diversi tipi di strumenti SLS: RALS, LALS, Hybrid RALS/LALS e MALS, ciascuno di questi ha delle sottili differenze e presenta vantaggi e svantaggi.

• LALS è la tecnica migliore per misure accurate di peso molecolare di molecole grandi (Rg 10-15nm) perché minimizza l’effetto della dipendenza angolare dello scattering ed elimina la necessità dell’estrapolazione.
• Le piccole molecole scatterano isotropicamente quindi non c’è dipendenza angolare. In questa situazione una singola misura a 90° (RALS) offre la misura più sensibile ed accurata per queste molecole che hanno uno scattering debole. Ciò include quasi tutte le proteine.
• Il MALS misura il peso molecolare delle molecole di ogni dimensione. Offre una maggiore comprensione della dipendenza angolare dello scattering per le molecole grandi (raggio > 10-15 nm) consentendo la più alta qualità e la maggior accuratezza nelle misure di Rg, confrontate con il sistema ibrido RALS/LALS. Rg può essere utilizzato per caratterizzare la struttura di queste molecole grandi.

La guida, scaricabile al link qui di seguito, descrive i principi e le teorie dietro alla static light scattering: vengono confrontate tecniche e tecnologie per consentire al lettore di fare scelte informate.

Lo scopo della guida è di fornire al lettore una chiara comprensione dei diversi approcci tecnologici usati per misurare il peso molecolare mediante il Light Scattering in un esperimento di GPC/SEC.