I farmaci basati sull’acido ribonucleico (RNA) stanno emergendo come una nuova classe di medicinali che sta rivoluzionando il campo medico. Recentemente sono stati tradotti con successo in terapie approvate clinicamente e sono considerati una delle tecnologie più promettenti per la prevenzione e il trattamento di molteplici malattie. La prima storia di successo è stata l’approvazione nel 2018 da parte della Food and Drug Administration (FDA) di un piccolo RNA interferente (siRNA) (Onpattro®) per il trattamento della polineuropatia nei pazienti affetti da amiloidosi ereditaria mediata da transtiretina, seguita da diverse terapie con oligonucleotidi antisenso, ad esempio per la distrofia muscolare di Duchenne. Gli esempi più recenti sono i vaccini a RNA messaggero (mRNA) (BioNTech/Pfizer, Moderna), sviluppati a una velocità senza precedenti contro il COVID-19. 

La trasposizione clinica delle terapie a base di RNA dipende in larga misura dall’uso di nanoparticelle lipidiche (LNP) che proteggono l’RNA (il principio farmacologico attivo API) dalla degradazione prematura e, allo stesso tempo, consentono l’assorbimento da parte delle cellule ospiti per veicolare l’RNA all’interno del citosol, pur essendo poco tossiche e poco immunogene. La recente e rapida approvazione regolamentare di vaccini LNP-mRNA ottimizzati contro la variante omicron della SARS-CoV-2 evidenzia uno dei vantaggi degli LNP come piattaforme di somministrazione: la capacità di modificare facilmente il carico di mRNA con un minimo aggiustamento rispetto alla formulazione iniziale dell’LNP. 

Le LNP utilizzate finora per la somministrazione clinica hanno una dimensione di circa 60-150 nm e sono composte da  

• lipidi ionizzabili che complessano l’RNA e ne facilitano la fuoriuscita dagli endosomi cellulari nel citoplasma; 
• lipidi coniugati con polietilenglicole (PEG) che forniscono stabilità e riduzione della clearance); 
• lipidi strutturali come colesterolo e fosfolipidi.  

Al momento della formazione dell’LNP-RNA, le nanoparticelle sono tenute insieme principalmente da interazioni elettrostatiche e idrofobiche. 

È da notare che l’RNA agisce sia come componente strutturale delle LNP sia come API. Questo aspetto è stato recentemente evidenziato da Hemmrich e McNeil, che hanno sottolineato le discrepanze nella classificazione dei componenti lipidici come principio attivo o eccipienti/ingredienti attivi nella valutazione normativa dei vaccini a base di mRNA per COVID-19. 

L’accurata caratterizzazione fisica, chimica e strutturale degli LNP-RNA è un prerequisito per la valutazione preclinica della qualità, dell’efficacia e della sicurezza di questi complessi terapeutici. È inoltre essenziale per accelerare la traduzione clinica e ridurre i costi durante il processo di sviluppo. Recentemente, una strategia di caratterizzazione per i nanovaccini ha presentato un processo iterativo che collega la misurazione delle principali proprietà fisiche, chimiche e di stabilità all’efficacia in vitro e alla tossicità in vitro.  

La misurazione delle proprietà chiave delle formulazioni complesse di LNP-mRNA è impegnativa. I documenti guida dell’FDA e dell’ICH Q2R2 applicabili alle due formulazioni complesse di LNP-mRNA COVID-19 sottolineano la necessità di un’adeguata caratterizzazione e suggeriscono di combinare tecniche ortogonali, per la convalida della misurazione di attributi di qualità complessi. 

In questo lavoro, partendo dalle esperienze del Nanotechnology Characterization Laboratory (NCI-NCL), dell’European Nanomedicine Characterisation Laboratory (EUNCL) e dai saggi di caratterizzazione specificamente incentrati sui nanovaccini recentemente pubblicato dal Joint Research Centre della Commissione Europea (JRC), è stata testata la strategia di caratterizzazione proposta e valutata l’applicabilità di otto tecniche analitiche per la misurazione di proprietà chiave per la caratterizzazione preclinica di due formulazioni di LNP-mRNA. 

Le proprietà fisico-chimiche chiave (dimensioni, concentrazione delle particelle, densità e composizione chimica) sono state valutate con misurazioni ortogonali e poi associate a test di efficacia in vitro e di tossicità in vitro. Poiché i cambiamenti nelle proprietà fisico-chimiche sono collegati a cambiamenti nell’efficacia in vitro e nella tossicità in vitro, in questo lavoro viene presentato il potenziale analitico di tecniche di caratterizzazione opportunamente selezionate per identificare, osservare e misurare differenze significative tra i) formulazioni e ii) variabilità da lotto a lotto dello stesso sistema LNP-RNA, dimostrando l’importanza della composizione chimica, del carico di farmaco, della densità delle particelle e delle proprietà strutturali rispetto alle informazioni sulla dimensione e sulla concentrazione delle particelle. 

Ulteriori attributi di qualità della formulazione completa (il prodotto farmaceutico, nella terminologia normativa) sono più specifici per l’mRNA (come l’identità e la purezza) e non sono stati trattati in questo lavoro. 

Cinque laboratori di caratterizzazione sono stati coinvolti in questo esercizio; sono state eseguite almeno tre misurazioni indipendenti dello stesso campione, come riassunto nella Tabella 1.