Introduzione

La sviluppabilità e gli screening delle formulazioni dei biologici richiede molto tempo e lavoro. Lo scambio del tampone è parte del problema visto che i metodi convenzionali sono inclini all’incoerenza e sono difficili da maneggiare in grandi quantità. Molti flussi di lavoro usano molteplici strumenti per determinare la concentrazione delle proteine, la qualità del campione e la stabilità, il che richiede più tempo e più campioni. Gli strumenti analitici con una richiesta di volume di campione troppo alta danno problemi di scambio di tamponi. Il modo migliore per uscire da questo ciclo è con tecniche versatili, ad alto rendimento e non impegnative per accelerare e semplificare gli screening di formulazione e sviluppabilità.

Il sistema di scambio automatizzato dei tamponi può consentire una gestione più uniforme dei campioni e gradi di controllo del processo che sono impraticabili e inaccessibili con i metodi manuali. Big Tuna è un sistema di scambio tamponi a mani libere, a basso volume, ad alto rendimento che è perfetto per le biomolecole (Figura 1A). Lo scambio dei tamponi con Big Tuna è altamente personalizzabile e adattabile, permettendo lo scambio di tamponi fino a 96 o 24 proteine e formulazioni uniche in un singolo esperimento, a seconda della piastra. I pozzetti delle piastre Unfilter 96 possono trattare fino a 96 campioni da 100-450 μL; le piastre Unfilter 24 possono trattare 24 campioni da 0,45-8 mL per pozzetto. Il design di ogni piastra ha diverse opzioni di filtri a membrana e materiali con taglio del peso molecolare (MWCO) perciò non è un problema trovare quello giusto per ogni situazione.

I metodi di ultrafiltrazione/diafiltrazione a pressione (UF/DF) rimuovono i tamponi mentre gentilmente mischiano i campioni, assicurandosi che la proteina non possa accumularsi sulla superficie della membrana. Questo inoltre mantiene il flusso più uniforme e veloce rispetto ai metodi di filtrazione a vicolo cieco. Big Tuna automatizza il processo di scambio del tampone, riducendo il tempo che si passa con le mani sullo strumenti e incrementa il rendimento. Big Tuna inoltre può aggiungere o rimuovere il tampone da un campione per impostare la concentrazione del campione su un nuovo target al termine dello scambio.

Figura 1. Big Tuna (A) automatizza lo scambio del tampone fino a 96 campioni unifici. Stunner (B) è l’unico sistema a piastra che unisce i dati UV/Vis e DLS sullo stesso campione da 2 μL.

L’assorbanza UV/Vis è un metodo classico per determinare la concentrazione delle proteine in una soluzione o la percentuale di recupero da un processo, come lo scambio di tamponi. La dynamic light scattering (DLS) è il metodo per eccellenza per determinare in modo non distruttivo se una proteina si è aggregata. Lo Stunner porta la qualità e la quantità dei campioni un passo avanti combinando l’ UV/Vis con la DLS per fornire la concentrazione, la grandezza e la polidispersità delle proteine di un singolo campione da 2  μL su un unico strumento (Figura 1B). così come il Big Tuna, lo Stunner utilizza una piastra a 96 pozzetti che rende semplice l’automazione e lo screening ad alta produttività.  Il tutto prende circa un minuto di tempo per campione senza il bisogno di diluizioni, standard o coloranti.

DLS e UV/Vis insieme possono un grande punto di partenza per gli studi sulla stabilità. I risultati DLS di una serie di diluizioni di una proteina consentono di determinare il parametro di interazione di diffusione (kD). La Static Light Scattering (SLS), che può essere raccolta insieme alla DLS, consente di ottenere il secondo coefficiente virale (B22). Queste metriche sono utili per determinare la propensione all’aggregazione – ampi valori positivi indicano che le proteine sono difficilmente aggregabili in una formulazione se la concentrazione delle proteine aumenta. I coefficienti B22 e kD possono essere determinati a concentrazioni tipiche delle fasi iniziali della ricerca, circa 10 mg/mL, ma indicano il probabile comportamento di una proteina mentre si muove dalla pipeline di sviluppo alla produzione. In questo modo si possono individuare potenziali problematiche prima che diventino dei problemi seri. La combinazione di UV/Vis e DLS di Stunner sullo stesso campione rende la misurazione di B22 e kD facile e veloce.

In questa nota applicativa è stato utilizzato il Big Tuna per per lo screening di 4 anticorpi monoclonali (mAbs) in 10 mM in 10 mM di istidina, pH 6,0, con lo 0,001% di polisorbato 80 (PS80) e 4 combinazioni di eccipienti comuni. Big Tuna ha monitorato lo scambio dei tamponi e ha assicurato che nessuna soluzione si asciugasse e raggiungesse la sua concentrazione finale. Big Tuna ha monitorato gli scambi di tampone e si è assicurato che nessuna soluzione si asciugasse e che tutto raggiungesse la concentrazione finale e l’obiettivo di scambio. Stunner è stato utilizzato per determinare la percentuale di recupero, la dimensione, la polidispersità, i coefficienti B22 e kD di ciascuna formulazione.

Conclusione

Completare più velocemente gli screening di formulazione ad alto rendimento identifica i biologici con i migliori profili di sviluppabilità e di scoprire quali combinazione di tamponi ed eccipienti li stabilizzano in modo più efficace. Lo scambio di tamponi automatico e fattibile a mani libere sul Big Tuna lascia gli scienziati meno tempo alle prese con tediose preparazione dei campioni e con più tempo per lavori critici. Lo Stunner dispone degli strumenti necessari per determinare la concentrazione di proteine, la percentuale di recupero dallo scambio del tampone o da un altro processo, individuare gli aggregati e persino scavare la propensione all’aggregazione. Combinando queste soluzioni in un unico flusso di lavoro lo screening delle formulazioni e candidati si semplifica.