I fluidi biologici normalmente contengono vescicole extracellulari (EVs), che sono rilasciate da diverse tipologie di cellule e sono in grado di imitare specifiche funzioni cellulari. Queste particelle di membrana, secrete sia da cellule eucariotiche che procariotiche, svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare (Lo Cicero et al., 2015; Shao et al., 2018) trasportando un cargo molecolare nativo o proveniente dalla cellula di origine (Théry et al., 2018). Nel 2015, una nuova tipologia di cellule staminali del liquido amniotico sono state indentificate, le quali rilasciano EVs con notevoli proprietà immunoregolatrici e tollerogeniche in vitro e in vivo (Romani et al., 2015).
Il fluido amniotico, un ambiente dinamico che si evolve durante la gravidanza, adempie a diverse funzioni che vanno dal nutrimento del feto alla promozione della crescita, fino alla protezione contro le infezioni (Theis et al., 2019; Tong et al. 2009). In particolare, il fluido amniotico umano ospita popolazioni eterogenee di cellule staminali con un potenziale terapeutico e rigenerativo significativo (De Coppi et al., 2007). Le cellule staminali del fluido amniotico umano (HAFSCs) rappresentano una strada promettente per l’esplorazione terapeutica, con il potenziale di rendere le EVs un’alternativa interessante alle terapie a base di cellule staminali (Balbi et al., 2017). Nonostante questi progressi, non sono ancora noti gli esatti bersagli cellulari di queste EV immunoregolatrici.
Le cellule dendritiche (DCs), in qualità di attori-chiave del sistema immunitario innato, hanno il ruolo specifico di presentazione dell’antigene, con la conseguente capacità di attivare le cellule T naïve e di influenzare significativamente le risposte immunitarie (Guilliams & van de Laar, 2015). La loro natura eterogenea dipende da differenze in termini di origine, posizione, funzione e percorsi migratori (Anderson et al., 2021). Sia le DCs umane che quelle murine si suddividono in macropopolazione, ovvero le DCs convenzionali (cDCs) e le Cds plasmocitoidi (pDC), le quali popolazioni nascono da cellule progenitrici del midollo osseo e si differenziano in sottopopolazioni presenti in diversi tessuti (Durai & Murphy, 2016; Guilliams et al., 2016). La popolazione di cDCs comprende i sottoinsiemi cDC1 e cDC2, ognuno caratterizzato da specifici fattori di trascrizioni e marcatori di superficie. Il sottoinsieme cDC1, che richiede fattori di trascrizione lrf8, ld2 e Batf3, esprime marcatori caratteristici come XCR1, BTLA, CD8a e DEC-205 (Durai et al., 2029). Lo svilluppo delle cDC2 è invece regolato dai fattori di trascrizione lrf4 e Notch2 e queste cellule sono caratterizzate dall’espressione di CD172a (SIRPa), DCIR2 e CD11b sulla superficie della cellula (Iberg et al., 2017). Le DCs attivate esprimono molecole MHC, recettori co-stimolatori e citochine proinfiammatorie, e inducono la proliferazione delle cellule T (Liu et al., 2021).
Oltre alle loro funzioni immunogeniche, le DCs giocano un ruolo cruciale nell’innescare la tolleranza immunologica. Contribuiscono alla tolleranza centrale controllando la delezione timica delle cellule T self-reattive, e la produzione di cellule T regolatorie (tTreg) sempre a livello del timo (Klein et al., 2019). Le Dcs tollerogeniche (tolDCs) sono la chiave per mantenere la tolleranza immunologica (Yoo & Ha, 2016). Sono caratterizzate da bassi livelli di molecole co-stimolatorie, alti livelli di citochine anti-infiammatorie (Thomson & Robbins, 2008) e dall’espressione di checkpoint immunitari inibitori (Barroso et al., 2021; Mohammadi et al., 2023). Ricerche recenti hanno mostrato che le DCs mature arricchite con molecole immunoregolatrici (mregDCs) sono un elemento chiave per sopprimere risposte immuni in specifici microambienti (Maier et al., 2020). Data la suscettibilità delle DCs alla modulazione ambientale, è plausibile ipotizzare che le EVs contenenti molecole biologicamente attive, rilasciate da specifici tipi cellulari, potrebbero influenzare la plasticità e la funzionalità delle DCs, specialmente per quanto riguarda le cDCs che sono spesso sregolate in malattie autoimmuni come è mostrato nei topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello di sclerosi multipla umana (Heink et al., 2017; Mundt et al., 2019).
La sclerosi multipla (MS) è una delle più comuni malattie infiammatorie e demielinizzanti del sistema nervoso centrale (CNS) (Jakimovski et al., 2023). L’interazione di complessi fattori genetici e ambientali influenza la suscettibilità alla sclerosi multipla (Bjornevik et al., 2022). Nonostante i recenti progressi nel prevenire ricadute tramite terapie sistemiche, la loro limitata efficacia nel controllare la progressione continua e indipendente della malattia rappresenta un ostacolo importante. Comprendere i meccanismi sottostanti e sviluppare terapie che fermano o prevengono la progressione della malattia sono sfide chiave nel campo della sclerosi multipla.
L’obbiettivo di questo studio era quello di investigare se EVs derivate da HAFSC (HAFSC-EVs) possano essere in grado di convertire il sottoinsieme delle cDC murine in cDC regolatrici, e di valutare il loro potenziale terapeutico in un modello murino. In particolare, si è scoperto che le HAFSC-EVs sono internalizzate in modo preferenziale dalle cDC2, spesso deregolate in presenza di sclerosi multipla (MS). Questo uptake preferenziale porta alla riprogrammazione delle cDC2 con manifestazione di un fenotipo tollerogenico, suggerendo che le HAFSC-EV potrebbero essere una potenziale piattaforma per lo sviluppo di strumenti basati sulle DC regolatorie per il trattamento di malattie autoimmuni o infiammatorie.
Nanoparticle tracking analysis (NTA)
Una aliquota di HASFC-EVs è stata caricata all’interno dello strumento NanoSight NS300 (Malvern, UK, NTA 3.4 Build 3.4.003 version) per misurare la concentrazione e le dimensioni delle particelle presenti nel surnatante delle cellule staminali del liquido amniotico. È stata utilizzato un protocollo di iniezione a flusso constante e sono stati acquisiti 5 video da 60 secondi per ogni campione, utilizzando una camera sCMOS come detector e una sorgente laser Blue488 per lo scattering. I diametri idrodinamici delle HAFSC-EVs p100 sono stati calcolati tramite equazione di Stokes-Einstein e l’analisi è stata eseguita con il software NTA 2.3. Il numero di vescicole è espresso come media ± SD. Tutti i parametri per la misurazione rispettano le linee guida dello strumento.
Le informazioni sul numero di particelle ottenute dell’analisi NTA hanno permesso di titolare con precisione la quantità di EVs da utilizzare nei saggi di uptake (nel range 0,65-0,52 x 10^9) e di dosarle in precisi rapporti rispetto alla quantità di cellule”. Per gli esperimenti di assorbimento sono stati utilizzati 2,6 × 10^9 (HAFSC-EVshigh) o 1,3 × 10^9 (HAFSC-EVslow) per 1 × 10^6 cellule. Per tutti gli esperimenti funzionali sono state utilizzate le dosi più basse di EV (1,3 × 10^9). Questo dosaggio è stato scelto per garantire effetti biologici ottimali.
Da sinistra:
– istogramma di distribuzione dimensionale e concentrazione per HAFSC-EVs, ottenuto tramite analisi NTA con Nanosight NS300 (spettro rappresentativo). I valori in blu corrispondono alle dimensioni dei picchi principali.
– Violin plots di moda e media di distribuzione dimensionale (nm) e media di concentrazione (particles/ml) per i campioni di HAFSC-EVs. Valori ottenuti tramite analisi NTA.
