Recentemente i virus adeno-associati (AAV) hanno suscitato molto interesse nella ricerca sulla terapia genica per il rilascio di geni modificati nelle cellule bersaglio per trattare o prevenire una patologia sostituendo un gene mutato con una copia sana del gene. I virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) sono oggetto di un intenso studio nello sviluppo di terapie geniche. Tuttavia, al fine di sviluppare terapie rAAV efficienti, dobbiamo affrontare molteplici sfide, come una progettazione ottimale, le condizioni di processo e formulazione e il controllo di qualità.(Figura 1).
Figura 1. Attività essenziali e attributi di qualità richiesti per lo sviluppo di vettori virali stabili ed efficaci (DSP – downstream processing).
L’importanza delle tecniche ortogonali
La gamma di tecnologie Malvern Panalytical può fornire importanti informazioni per un rapido sviluppo di terapie geniche. La tabella 1 riassume i parametri chiave che i ricercatori devono considerare e quali tecniche della Malvern Panalytical possono fornire tali informazioni.
| Parametri essenziali del campione | Tecnologie Malvern Panalytical |
| Dimensioni del capside | DLS, NTA |
| Peso atomico (Mw) assoluto di capsidi virali e transgene | SEC–MALS |
| Titolo del capside o conta delle particelle | MADLS®, SEC-MALS, NTA |
| Percentuale di particelle virali contenenti genoma/% analisi completa | SEC–MALS |
| Formazione di aggregati | DLS, MADLS, SEC–MALS, NTA |
| Frammentazione | SEC–MALS |
| Stabilità termica | DLS, DSC |
| Analisi della struttura di ordine superiore | DSC |
| Identificazione del sierotipo | DSC |
| Spoliazione del capside ed espulsione del genoma | DLS, DSC |
| Legame al recettore | ITC |
| Carica | ELS |
DLS dynamic light scattering, SEC-MALS size exclusion chromatography multi-angle light scattering, NTA nanoparticle tracking analysis, MADLS multi-angle dynamic light scattering, DSC differential scanning calorimetry, ITC calorimetria di titolazione isotermica, ELS electrophoretic light scattering.
DLS, MADLS, SEC-MALS, NTA, ITC, e DSC sono tecniche biofisiche label-free che richiedono uno sviluppo minimo del test e possono essere prontamente applicate in tutte le fasi, rafforzando il flusso di lavoro analitico per lo sviluppo della terapia genica. Recentemente sono state utilizzate più tecniche ortogonali per caratterizzare i rAAV e questo lavoro è stato pubblicato sul Pharmaceutics Journal.
Analisi del capside pieno e vuoto
La tecnica SEC, insieme all’analisi composizionale, può aiutare a determinare la concentrazione e il peso molecolare di due componenti distinti all’interno di un campione. Ad esempio, nella Figura 2 è mostrato un cromatogramma a rivelazione multipla per un rAAV5 vuoto. Il segnale dell’indice di rifrazione (RI) è rappresentato dal canale rosso, l’ultravioletto (UV) a 260 nm dal canale viola ed il detector right-angle light scattering (RALS) dal canale verde. Per generare i dati nella Tabella 2 per i rAAV vuoti è stato applicato un metodo di analisi composizionale.
Tabella 2: Parametri quantitativi per rAAV5 (vuoto)
| Parametro | Monomero | Dimero | Aggregati | Frammenti |
| Mw (g/mol) | 3,84 x 106 | 6,98 x 106 | 1,77 x 107 | 821.849 |
| Mw/Mn | 1,001 | 1,010 | 1,175 | 1,695 |
| Frazione di campione (%) | 84,7 | 7,2 | 2,7 | 5,4 |
| Frazione di proteina (%) | 99,8 | – | – | – |
Titolo totale per campione (monomero e aggregato) = 5,91 x 1013 capsidi/mL (2,6% RSD).
Figura 2. Cromatogramma a tripla rivelazione di rAAV5 (vuoto). Rosso = RI, Viola = UV 260 nm, Verde = RALS.
Le tecniche DLS e MADLS possono determinare la dimensione di rAAV5 pieno e vuoto (rispettivamente 27 ± 0,3 e 33 ± 0,4 nm) (Figura 3). L’intervallo lineare per la determinazione delle dimensioni e del titolo di rAAV5 con MADLS è stato stabilito da 4,4 x 1011 a 8 x 1013 capsidi/mL per i campioni nominalmente pieni di rAAV5 e da 3,4 x 1011 a 7 x 1013 capsidi/mL per i campioni nominalmente vuoti di rAAV5.
Figura 3: Distribuzioni delle dimensioni delle particelle di intensità ottenute per campioni rAAV vuoti e pieni utilizzando MADLS.
Possiamo dedurre la stabilità strutturale e il rilascio della carica virale da una combinazione di DLS, SEC-MALS e calorimetria a scansione differenziale (DSC). Le caratteristiche strutturali del rAAV5 iniziano a cambiare da 40 °C in poi, dove si osserva un’aggregazione crescente.
In questo studio, abbiamo esplorato e dimostrato l’applicabilità e il valore delle tecnologie ortogonali e complementari label-free per una migliore caratterizzazione indipendente dal sierotipo delle proprietà essenziali e del profilo di stabilità dei campioni di rAAV5. È importante sottolineare che la caratterizzazione può essere condotta senza la necessità di standard di calibrazione AAV, sviluppo di metodi estensivi o reagenti dedicati.
I risultati di questo studio sono presentati anche nel seguente webinar a cura di Malvern Panalytical “Delving Deeper Into AAV Attributes: Enhanced Characterization Using Multiple Technologies“(clicca qui per guardarlo)
