La misura accurata ed efficiente delle interazioni molecolari e di eventi di legame è un aspetto critico in tutti i campi della ricerca di base biochimica ed è indispensabile nella ricerca farmaceutica.

I Test di interazione possono essere eseguiti in svariati modi ma il più efficace resta l’approccio in tempo reale e senza marcatura, possibile con tecniche come la Surface Plasmon Resonance o la più sensibile CGI implementata sui sistemi Creoptix dove il campo evanescente coinvolge tutto il sensore e non ne è limitato ad una sua porzione (Fig. 1).

Figura 1 Rappresentazione schematica di un sensore SPR (sx) ed un sensore CGI (dx). A parità di superfice è evidente la maggiore quantità di campione coinvolto nella tecnica CGI garantendo una maggiore quantità di segnale e quindi una maggiore sensibilità

In un tipico esperimento SPR o CGI, a seguito dell’immobilizzazione della molecola target (ligando) sulla superficie del biosensore, l’analita viene iniettato ripetutamente a concentrazioni fisse crescenti; ciascuna iniezione avviene con le stesse modalità e durata. Man mano che l’analita interagisce, l’indice di rifrazione cambia proporzionalmente alla massa dell’analita legato. Successivamente, durante la fase di dissociazione, il segnale ritorna alla linea di base, con o senza rigenerazione a seconda delle cinetiche. In alcune particolari configurazioni strumentali, le diverse concentrazioni di analita sono aumentate progressivamente in un esperimento senza rigenerazione.

Figura 2 Rappresentazione schematica di un esperimento tradizionale FCI – Fixed Concentration Injection. C(t) mostra l’iniezione delle diverse concentrazioni in funzione del tempo. R(t) è la risposta del sensore, sempre in funzione del tempo. Le due funzioni sono combinate per determinare le costanti cinetiche e di affinità

In entrambi gli approcci sono comunque richieste diverse concentrazioni e questo spesso può portare ad artefatti legati agli effetti bulk dell’indice di rifrazione soprattutto quando le concentrazioni dell’analita sono significative. Creoptix ha sviluppato un nuovo approccio analitico per abbattere queste limitazioni.

Il metodo waveRAPID (Repeated Analyte Pulses of Increasing Duration) impiega pulsazioni dell’analita, a concentrazione fissa, ma di diversa durata.

Come nell’approccio tradizionale (FCI), i sensogrammi registrati sono la risposta delle concentrazioni di analita iniettate in funzione del tempo. Il metodo waveRAPID però non si basa sull’iniezione di diverse concentrazioni per creare una funzione, tempo dipendente, delle diverse concentrazioni ma impiega un sofisticato sistema che varia la durata delle iniezioni. Un grande vantaggio del metodo waveRAPID è che il responso può essere analizzato interpretando solamente la fase di dissociazione. Questo consente di superare uno dei principali inconvenienti delle tecniche basate sulla misura dell’indice di rifrazione e dovuto ai disturbi di questa proprietà legati alle componenti del buffer.

Figura 3 Rappresentazione dell’approccio waveRAPID. C(t) mostra mostra le diverse iniezioni, della medesima concentrazione, di diversa durata, in funzione del tempo. R(t) è la risposta del sensore. Come, nell’approccio FCI, è possibile combinare le due funzioni per ottenere i parametri cinetici. Gli esperimenti waveRAPID possono inoltre essere interpretati considerando solamente la porzione di dissocazione (linee blu nel sensogramma a dx).

Esistono altre tecniche in grado di eseguire un ciclo cinetico completo a partire da una singola concentrazione ma dipendono da processi quali la diffusione nel mezzo che possono variare tra molecole, anche a parità di peso molecolare, portando a comportamenti diversi e quindi ad un errore del modello che ricostruisce la funzione c(t). Nel sistema waveRAPID le iniezioni avvengono a concentrazione costante, è la variazione della durata dell’iniezione a generare la risposta c(t), in maniera indipendente quindi dal comportamento fisico degli analiti.

L’approccio waveRAPID consente di ottenere gli stessi parametri cinetici, ma a partire da un singolo pozzetto e in un tempo estremamente più rapido, estendendo notevolmente il troughput sperimentale ma senza perdere robustezza e riproducibilità.

Figura 4 Confronto tra un esperimento waveRAPID e un esperimento tradizionale

Figura 5 Interazione tra CAII e Furosemide. Riproducibilità delle analisi ottenute variando diversi parametri come densità di ligando, concentrazione di analita e parametri di iniezione

La tecnologia waveRAPID è particolarmente indicata nell’ambito degli high-throughput screening cinetici. Esperimenti possono essere completati in pochi minuti consentendo l’analisi di librerie in poche ore. Grazie ai rapidi tempi sperimentali, anche specie poco stabili possono essere facilmente analizzate.

Figura 6 Screening di 90 molecole; tempo sperimentale 18 ore. Evidenziati in verde composti di controllo per verificare le condizioni del sistema e la stabilità della superficie del chip

La tecnologia waveRAPID definisce un nuovo standard per lo studio delle cinetiche di interazione. Preparazione del campione più semplice, nessuna correzione per DMSO e risultati completi da una singola iniezione consentono di ottenere tutte le informazioni necessarie direttamente da uno screening primario, incrementando drammaticamente il throughput sperimentale. Inoltre, grazie alla superiore sensibilità, garantita dalla tecnica CGI, interazioni deboli e composti con alti tassi di dissociazione possono essere caratterizzati correttamente.