Leprechaun

Misura la dimensione delle Vescicole Extracellulari

Il sistema Leprechaun sfrutta le immagini ottenute dalla riflettanza interferometrica di singole particelle (SP-IRIS) e misura le dimensioni delle singole EV con elevata precisione, analizzando il segnale interferometrico delle EV legate ad un substrato. Questa metodologia consente di visualizzare e caratterizzare EV di piccole dimensioni, fino a 35 nm. L’intensità del segnale interferometrico è correlabile al raggio delle particelle elevato al cubo, conferendo alla misura un’elevata capacità di risoluzione rispetto alle tecniche esistenti. I campioni contenenti EV presentano spesso un’elevata polidispersione e numerose sottopopolazioni; pertanto, la risoluzione della misura è un requisito importante: il sistema Leprechaun ha una risoluzione picco-picco significativamente elevata e consente di rilevare e separare in modo più accurato sottopopolazioni di vescicole distinte all’interno di un campione eterogeneo. L’alta risoluzione del sistema Leprechaun è stata dimostrata separando cinque popolazioni di particelle sferiche di polistirene certificate NIST di dimensioni diverse (40nm, 70nm, 100nm, 150nm e 200nm) in una singola analisi. Pur sapendo che le particelle di polistirene non sono equiparabili alle EV, l’esperimento dimostra le capacità di risoluzione intrinseca della tecnica.

Concentrazione delle EV

Il sistema Leprechaun consente di misurare il numero di EV legate ad un chip, correlandolo alla concentrazione di vescicole positive ad uno specifico marcatore. Vengono eseguiti test di controllo per garantire che gli eventi di legame misurati siano specifici e non correlati ad interazioni aspecifiche o a componenti aggregate del campione. L’array viene analizzato prima dell’incubazione del campione e qualsiasi evento contaminante può essere escluso dall’analisi. Allo stesso modo, gli eventi di legame non specifici osservati sul controllo negativo possono essere sottratti dai risultati sperimentali.

Fluorescenza a 3 canali

Il sistema Leprechaun consente la misura in fluorescenza fino a 3 colori su singole EVs legate al chip.
Le vescicole extracellulari in soluzione vengono “catturate”, senza purificazione, e legate a uno dei diversi anticorpi di cattura sulla superficie del chip. È possibile aggiungere anticorpi fluorescenti secondari e misurare fino a 3 colori contemporaneamente.
L’elevata sensibilità del sistema Leprechaun può rilevare fino al singolo evento di legame, questo significa che anche le proteine scarsamente espresse sulla più piccola delle vescicole extracellulari saranno rilevabili.

Colocalizzazione dei biomarcatori

Questa immagine mostra le vescicole legate a un singolo spot di catturaanti-CD41a sul chip. Tutte le vescicole fotografate in questo punto sono quindi positive per CD41a.
Una volta legate, le vescicole sono state colorate con un “cocktail” di anticorpi fluorescente anticorpi contro CD63 / CD81 / CD9.
I punti blu sono vescicole positive per CD41a + CD63.
I punti verdi sono vescicole positive per CD41a + CD81.
I punti rossi sono vescicole positive per CD41a + CD9.

Altri colori sono vescicole che esprimono varie combinazioni di segnale fluorescente R / G / B e CD41a (tramite acquisizione in superficie).
Tutte le vescicole vengono simultaneamente dimensionate e contate.
La colocalizzazione dei biomarcatori (4 marker per EV) consente di identificare e misurare sotto-popolazioni uniche di vescicole extracellulari.

Rilevamento di marcatori luminali (cargo) attraverso la fluorescenza

Una volta legate al chip, le vescicole extracellulari possono essere rese permeabili per il riconoscimento di proteine luminali e/o il loro contenuto.
Questi esperimenti mostrano la capacità di rilevare proteine luminali, come ALIX e Sytenin, consentendo di dimostrare l’integrità delle vescicole catturate e aumentare la robustezza e la significatività dell’esperimento.