Introduzione

Le menti degli scienziati che lavorano con campioni contenenti nanoparticelle sanno quante informazioni sono necessarie per una caratterizzazione adeguata, a seconda della loro natura e applicazione. Nel settore della nanomedicina, le nanoparticelle lipidiche (LNPs) hanno suscitato un notevole interesse per la loro capacità di agire come cargo trasportando farmaci o materiale genetico (payload). In particolare, dopo l’utilizzo nei vaccini per COVID-19, il loro potenziale è chiaro a tutta la comunità scientifica.

Tuttavia, la caratterizzazione di un campione di LNPs può essere un processo lungo e complesso. Ottenere informazioni fondamentali come concentrazione, dimensione e quantità di materiale incapsulato richiede spesso l’impiego di strumenti e saggi differenti, ciascuno con i propri tempi di analisi e preparazione. Il risultato è un’attività che può richiedere ore di lavoro, oltre a un notevole consumo di campione e reagenti.

Stunner di Unchained Labs è l’unica piattaforma che accoppia le tecniche UV/Vis e Rotating Angle Dynamic Light Scattering (RADLS) al fine di ottenere con un’unica misura le informazioni necessarie. Tutto questo avviene utilizzando appena 2 μL di campione, senza necessità di diluizioni, standard o marker fluorescenti, e con la possibilità di analizzare fino a 96 campioni contemporaneamente.

Ma ora, mettiamoci nei panni di uno scienziato che ha appena prodotto le sue LNPs caricate con RNA e necessita di caratterizzarle. Vediamo come può risparmiare tempo, materiale ed energie utilizzando le tecniche di Stunner!

Caratterizzazione dimensionale e concentrazione

Per offrire informazioni sulla dimensione e sulla concentrazione delle LNPs, Stunner impiega la tecnica RADLS, che rappresenta un’evoluzione delle classiche Dynamic Light Scattering (DLS) e Static Light Scattering (SLS). Grazie alla capacità di acquisire i dati da più angolazioni, consente una caratterizzazione accurata anche di campioni complessi, in particolare quelli contenenti particelle di grandi dimensioni o popolazioni multiple, che la DLS tradizionale ha difficoltà ad analizzare.

Stunner può contare su un detector rotante che acquisisce il segnale a più angoli permettendo di ottenere parametri di misura indipendenti dall’angolo di osservazione. Con l’analisi multi-angolo, anche le particelle che normalmente “sfuggirebbero” alla rilevazione vengono correttamente analizzate, offrendo così un quadro completo del campione.

Figura 1. Schema del funzionamento della tecnica Rotating Dynamic Light Scattering (RADLS) implementata su Stunner.

Le misure RADLS ci offriranno le informazioni sulla dimensione e polidispersità delle nostre LNPs con i parametri di diametro idrodinamico medio (Z-Average) e indice di polidispersità (PdI), e le distribuzioni pesate su intensità, massa o numero.

Figura 2. Distribuzioni pesate su intensità, massa e numero di un campione omogeneo di LNPs

Inoltre, le misure ad angolo rotante permettono di risalire alla concentrazione valutando la correlazione tra dimensione della particella e luce diffusa. In Figura 2 è visibile, come la misura sia robusta anche al variare del rapporto di diluizione del campione.

Figura 3. Concentrazione stimata lungo una serie di diluizioni a fattore cinque, fino a una diluizione finale di 1:625, effettuata su un campione di LNP di piccole dimensioni. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard calcolata su 4 repliche analizzate su ciascuno dei 5 strumenti.

Quantificazione del payload

Per caratterizzare la quantità di payload nelle LNPs, Stunner rende tutto rapido e semplice. Nella stessa sessione di misura della RADLS, il campione viene anche analizzato utilizzando il la tecnica UV/Vis. Ottenuto lo spettro di assorbimento totale del campione, Stunner utilizza librerie specifiche per il tipo di campione in esame (e.g. RNA-LNPs, DNA-LNPs, protein-LNPs) e attua gli algoritmi dedicati Unmix che permettono di estrarre informazioni anche da campioni sfidanti come le LNPs, superando l’ostacolo della torbidità.

Gli algoritmi Unmix attuano una deconvoluzione del segnale totale di assorbimento, estraendo il contributo all’assorbimento dei singoli componenti dallo spettro di assorbimento totale, in modo da offrire informazioni separate su LNPs & buffer, RNA e torbidità. Questo processo permette di conoscere la quantità totale di RNA in μg/mL e numero di molecole presenti nel campione, fornendo informazioni sul payload.

Figura 4. Gli algoritmi Unmix permettono di estrarre il contributo di torbidità, RNA e Lipids & Buffer dallo spettro totale di assorbimento UV/Vis.

Il metodo offerto da Stunner è stato anche confrontato con il metodo validato RiboGreen® per la determinazione della quantità di RNA totale nel campione mostrando una marcata sovrapposizione dei valori ottenuti, anche al variare della diluizione impiegata, confermando la robustezza e l’affidabilità della misura (Figura 5).

Figura 5. Valori di RNA totale su campioni di Fluc-mRNA-LNPs ottenuti con Stunner e RiboGreen® (A). Serie di diluizioni 1:2 di Fluc-mRNA-LNPs fino a una concentrazione di 1,2 μg/mL (B). I dati Stunner rispettano la quantità attesa di RNA e sono confrontabili al RiboGreen®.

Se la sola determinazione dell’RNA totale non fosse sufficiente per determinare il materiale incapsulato, è possibile integrare i dati ottenuti con Stunner con ulteriori analisi con metodi tradizionali, creando così un workflow ibrido che combina tecniche differenti ma fornisce risultati sovrapponibili (ad esempio con RiboGreen®). Il risparmio in termini di tempo, costi e risorse resta significativo: utilizzare Stunner consente di dimezzare le analisi dye-based, riducendo il numero di campioni e reagenti, di curve di calibrazione, i tempi di incubazione, le attività manuali a carico dell’operatore e dei costi.

Ad esempio, il calcolo dell’efficienza di incapsulamento (EE%) risulta notevolmente semplificato: Stunner fornisce rapidamente il valore di RNA totale, mentre l’RNA libero può essere determinato aggiungendo il colorante RiboGreen® al campione diluito e utilizzando un’unica curva di calibrazione, da analizzare con i metodi tradizionali.  In Figura 5 si vede come i dati ottenuti siano confrontabili, a conferma dell’affidabilità delle misure.

Figura 6. Efficienza di incapsulamento (EE%) di tre formulazioni di LNPs calcolate utilizzando il metodo ibrido Stunner/RiboGreen® (verde) e il saggio standard RiboGreen® (grigio).

Potenzialità di Stunner

Grazie alla rapidità e completezza delle analisi, Stunner si rivela uno strumento essenziale per l’ottimizzazione dei processi di produzione delle LNPs, grazie alla rapidità e all’accuratezza con cui fornisce informazioni dimensionali e sul payload. Ad esempio, in un processo di ottimizzazione basato su piattaforme microfluidiche come Sunshine o Sunscreen, le LNPs ottenute variando parametri come il Total Flow Rate (TFR) possono essere immediatamente caratterizzate a 360° con Stunner. Con un impegno operativo minimo, è possibile ottenere rapidamente tutte le informazioni necessarie a prendere decisioni mirate e accelerare lo sviluppo di formulazioni ottimali.

Figura 7. LNPs generate con Sunscreen con diversi valori di Total Flow Rate (TFR). Stunner raccoglie simultaneamente le informazioni necessarie per confrontare le particelle prodotte: dimensioni (A), concentrazione di particelle (B), concentrazione totale di RNA (C) e rielabora un numero medio di molecole di RNA per particella (D), assumendo il 100% dell’efficienza di incapsulamento.

Visita la pagina dedicata a Stunner di Unchained Labs per saperne di più sulle sue caratteristiche e applicazioni.